热休克蛋白70在老年性白内障晶状体上皮细胞中的表达及意义

目的:探讨热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)在老年性白内障晶状体上皮细胞中的表达及意义.方法: 采用PV-6000通用型免疫组织化学染色,检测老年性白内障晶状体前囊膜53例,其中皮质性白内障24例,核性白内障17例,后囊下白内障12例,正常人晶状体前囊膜6例中晶状体上皮细胞中HSP70的表达.并进行阳性细胞计数. 结果:老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中均有HSP70表达,其中HSP70在老年性白内障中表达明显高于正常对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).老年性白内障组各亚型间有显著性差异(P＜0.05).结论:HSP70可能在老年性白内障的发生、发展中起重要作用.     

HPV DNA和E6/E7 mRNA检测对宫颈病变诊断价值比较研究

目的评价高危HPVE6/E7mRNA在宫颈病变中的临床价值。方法将70例低度宫颈病变(慢性宫颈炎),子宫颈上皮内瘤变(CINI级)和78例高级别宫颈病变(包括CINⅡ级CINⅢ级和宫颈浸润性癌)分为两组。低度宫颈病变为对照组,高级别宫颈癌组为实验组。分别进行HPV DNA分型和HPV E6/E7 mRNA检测。结果低度子宫颈病变和高度子宫颈病变的阳性率分别为14.2%和79.5%。HPV DNA分型检测结果,低度子宫颈病变和高度子宫颈病变的阳性率分别为35.7%和85.7%。高风险HPV E6/E7 mRNA检测特异性,阳性预测值,阴性预测值(85.8%,86.1%,83.5%)显着高于(64.3%,70.5%,71.4%),差异有统计学意义。结论高危HPV E6/E7 mRNA检测有效降低了临床诊断中的过度检查和过度治疗的机会,避免了患者因高频重复感染引起的经济负担和精神压力。     

HPV16 E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E6／E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70（HSP70）表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠。分离脾细胞。用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平。用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫小鼠后，检测到的细胞因子IL-2，IFNγ的含量明显升高：与结核杆菌HSP70重组后。IL-2，IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后，IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6／E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果，但对体液免疫几乎没有影响。     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

热休克蛋白70调节突触融合蛋白Syntaxin 1在哮喘中的表达

目的探讨热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)对突触融合蛋白Syntaxin1(SYX1)在哮喘大鼠肺组织中表达水平的调节及相互作用。方法 30只健康Wistar大鼠按随机原则分为对照组、哮喘组、哮喘+地塞米松组,每组10只。通过卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏、激发建立哮喘大鼠模型,采用免疫组织化学、逆转录PCR及蛋白免疫印迹检测3组间HSP70及SYX1基因和蛋白表达水平,免疫共沉淀技术检测HSP70与SYX1的相互关系。结果与对照组比较,哮喘组HSP70及SYX1基因和蛋白表达水平均增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05);与哮喘组比较,哮喘组+地塞米松组HSP70及SYX1基因与蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05),但与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。免疫共沉淀结果显示在哮喘大鼠肺组织中HSP70与SYX1存在相互作用。结论 HSP70及SYX1在哮喘肺组织中表达水平均明显增高,HSP70通过调节SYX1表达水平及相互作用共同参与哮喘的发病机制,且其表达受地塞米松的抑制,为临床寻找药物干预新的靶点提供了理论依据。     

HPV16-E6蛋白在宫颈病变组织中的表达及临床应用

目的 研究人乳头瘤病毒16型E6蛋白（human papillomavirus-16 E6 protein,HPV16-E6）在宫颈病变组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系.方法 采用免疫组化S-P法检测HPV16-E6蛋白在宫颈正常组织、慢性炎症、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）、浸润癌上皮中的阳性表达情况.结果 HPV16-E6在正常宫颈、宫颈炎、CIN,宫颈癌各组中,阳性表达率分别为0.5%、38.35%、46.15%、71.11%,4组比较差异有统计学意义（χ2=27.50,P〈0.01）.经χ2分割后比较（α′=0.007143）,宫颈癌组、CIN组、宫颈炎组的阳性率显著高于正常宫颈组（P〈0.05）,宫颈癌组的阳性率显著高于宫颈炎组（P〈0.01）.HPV16-E6与年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润相关（P〈0.05）.结论 HPV16-E6与宫颈癌的启动、发生、发展及侵袭转移均密切相关.HPV疫苗对于宫颈癌的防治有广泛的应用前景.     

高危型HPV和其E6、E7 mRNA与宫颈病变的相关性研究

目的探讨高危型HPV和其E6、E7 mRNA与宫颈病变(CIN1、CIN2、CIN3、ICC)的相关性。方法随机选择120例宫颈病变患者组织标本,检测高危型HPV E6、E7 mRN;高危型HPV采用荧光PCR定量检测。分析高危型HPV和其E6、E7 mRNA与宫颈病变(CIN1、CIN2、CIN3、ICC)的相关性。结果在宫颈病变CIN1、CIN2、CIN3、ICC中,高危型HPV阳性表达率分别为87.5%、91.2%、93.3和95.8%。宫颈CIN1、CIN2,宫颈CIN2、CIN3,宫颈CIN3、ICC比较差异不显著(P>0.05);高危型HPV的E6、E7 mRNA阳性表达率分别为15.6%、35.3%、70.0和95.8%。宫颈CIN1、CIN2,宫颈CIN2、CIN3,宫颈CIN3、ICC比较差异显著(P<0.05)。结论高危型HPV与宫颈病变无相关性;高危型HPV E6、E7 mRNA与宫颈病变有相关性。     

热休克蛋白70在牙髓中的作用的研究进展

热休克蛋白又称应激蛋白,是普遍存在于生物体细胞中在热休克状态下启动的一系列特殊基因编码合成的蛋白质。它是由真核细胞产生的,在正常生理条件下低水平表达,当细胞暴露于特殊环境下时表达增高。因其在体内与多种多肽和蛋白质形成复合体,生理状态下在蛋白质的折叠与伸展,多肽     

人乳头瘤病毒E6、E7蛋白在宫颈分化上皮中的致病机制

随着对宫颈癌发病机理的深入研究,人乳头瘤病毒Human Papillomaviruses,HPV)是宫颈癌的致病因子已确定。高危型HPV E6和E7蛋白是病毒致癌蛋白,在宫颈癌的发生起重要作用,本文分别综述E6和E7致癌蛋白在宫颈分化上皮中的功能。     

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

目的 分析不同部位、分期的结直肠腺癌及正常黏膜组织中人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E7的表达状况。方法 应用PCR及免疫组化方法检测82例手术切除的结直肠癌新鲜标本及距肿瘤近端10cm以远的正常黏膜组织中HPV 16 E7 DNA及蛋白的表达。结果 结直肠癌组织HPV 16 E7 DNA表达阳性率为51．22％（42／82）,明显高于正常黏膜组织的4．88％（4／82）,P〈0．05;直肠癌组织中HPV 16 E7 DNA表达阳性率为64．10％（25／39）,明显高于升结肠癌的18．18％（2／11）,P〈0．05;HPV 16 E7 DNA表达阳性率与Dukes分期有关（P〈0．05）,与癌组织分化程度无关。免疫组化染色显示,HPV 16 E7蛋白主要为细胞核表达,胞浆亦可见少量表达,进一步确认了HPV 16的感染,且HPV 16 E7蛋白与HPV 16 E7基因的表达具有相关性,免疫组化敏感性较PCR方法为低。结论 结直肠癌组织HPV 16 E7 DNA及蛋白的表达阳性率明显高于正常黏膜组织,提示部分结直肠癌存在HPV 16感染。癌灶部位距肛门越近,感染率越高;Dukes分期越晚感染率越高。     

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化.方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI.在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定.结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrapKit成功纯化目的蛋白.ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性.结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础.     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.     

人粒细胞集落刺激因子基因重组及在E.coli中的表达和鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，转化含有pGP1－2质粒的E.coliDH5α，进行温度诱导表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体总蛋白量的30％以上。将其复性，经CM－52FF离子交换层析纯化，纯化后的rhG－CSF（纯度＞98％）经SDS－PAGE测定分子量约为19kD；经胰酶裂解、反相HPLC分析肽谱具有8条特异肽段；等电聚焦测定PI值约为5．8；免疫印迹实验证实其与标准hG－CSF具有相同的抗原反应特异性；NH2-末端氨基酸分析与文献报道一致，采用小鼠白血病细胞株NFS－60测定活性为I×108IU／mg。     

Prokaryotic expression and purification of fusion protein HSP70-EGFP and its application in the study of dendritic cells internalization antigen

To study the endocytic activity of dendritic cells (DCs) by obtaining fusion protein HSP70-EGFP as exogenous antigen and loading it with DCs derived from human peripheral blood. Fusion protein HSP70-EGFP was prokaryotically expressed, isolated and purified. DCs were isolated and cultured from human peripheral blood. The DCs were divided into 3 groups in the endocytic experiment. There were 10⁶ DCs in each group. Group 1 and 2 were respectively incubated for 30 min. with HSP70-EGFP and EGFP. Group 3 was incubated with HSP70 for 30 min, and then incubated for 30 min. with HSP70-EGFP. Subsequently, 3 groups were placed in an incubator at 37°C for 0.5, 1, 2 and 24 h. Flow cytometry (FCM) was adopted to detect the amount of DCs with EGFP inside. IL-12 Eli-spot was adopted to detect the amount of DCs which secreted IL-12. There were 5 types in the experiment: LPS, inactive LPS, HSP70-EGFP, EGFP and no antigen. Fusion protein HSP70-EGFP was successfully obtained and its molecular weight was 97 000. It accounted for 35.32% of the total protein. Under irradiation of an ultraviolet lamp, the protein solution sent out viridescent fluorescence. The result detected by FCM indicated that after incubation for 0.5 h at 37°C, the positive rate in group 1 was 63%, while the other 2 groups were negative. After incubation for 1, 2 and 24 h at 37°C, the positive rates in the 3 groups were above 80%. The IL-12 Eli-spot examination shows that with HSP70-EGFP being loaded, the amount of DCs secreting IL-12 was 134.09 ± 31.78/10⁵ cells, a little lower than that of DCs with LPS loaded (with the average point of 156.36 ± 15.73). There was no significant difference between the 2 groups (P < 0.01). By contrast, both of them were significantly higher than inactive LPS-(33.78 ± 1.40)/10⁵ cells and EGFP-loaded (23.13 ± 4.57)/10⁵ cells DC groups in the amount of DCs secreting IL-12 (P < 0.01). The results suggest that receptor-mediated phagocytosis plays a main role in the preliminary stage of DCs internalizing HSP70-EGFP. With increasing incubation time, pinocytosis begins to dominate. HSP70-EGFP may promote DCs to secret cell factor IL-12. __________ Translated from Journal of the Fourth Military Medical University, 2007, 28(12): 1057–1060 [译自: 第四军医大学学报]     

DJ-1融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定

<正>Nagakubo等[1]在1997年发现并报道了DJ-1之后,人们研究发现DJ-1基因突变与帕金森病(Parkinsons disease,PD)相关[2],此外,DJ-1还具有转录调控、抗氧化应激等功能[3-4]。目前DJ-1逐渐成为PD的研究热点,但国内尚未见有关DJ-1蛋白原核表达的报道。本试验使用GST标签的     

E-cadherin和HSP70在肝细胞癌中的表达

目的:探讨E-cadherin和HSP70在不同分化程度HCC中的表达情况以及两者的相关性。方法:采用免疫组织化学方法,检测41例肝癌组织及5例癌旁正常肝脏组织中E-cadherin和HSP70的表达情况。结果:E-cadherin在正常肝脏组织中呈高表达,而在HCC中表达降低且与分化程度有关,部分低分化的HCC组织中表达缺失(P<0.05);HSP70在HCC中表达升高,与正常组比较差异有显著性,且与分化程度有关。相关性分析发现E-cadherin和HSP70在HCC中的表达成负相关(r=-0.322,P<0.05)。结论:HCC中,E-cadherin表达降低,HSP70表达升高,提示两者在HCC侵袭和转移中存在一定的相关性。     

直肠癌组织中CD70蛋白的表达及意义

目的探讨直肠癌组织中CD70(TNFSF7)蛋白的表达及其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测60例直肠癌组织及癌旁组织中CD70、CD27(TNFRSF7)蛋白的表达,分析其与临床病理学特征的关系。结果 CD27、CD70在直肠癌组织中的阳性表达率分别为1.67%、33.33%;在直肠癌旁组织中均不表达。结论 CD70与直肠癌的发生发展密切相关,可作为判断肿瘤分期、指导治疗和预后判断的参考指标。