环氧酶-2在骨形态蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化中的作用研究

目的研究环氧酶-2(COX-2)在骨形态蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)成骨分化过程中的作用,以及COX-2影响BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR、蛋白印迹和免疫细胞化学染色分析BMP9对COX-2表达的影响。采用化学发光法检测碱性磷酸酶(ALP)的活性,用RT-PCR法检测Smad6、Smad7 mRNA表达水平,用蛋白印迹检测Runx2、Dlx-5、Smad1/5/8及磷酸化Smad1/5/8蛋白水平。通过体内异位成骨实验检测COX-2对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。利用萤光素酶报告质粒检测BMPs/Smads信号活化程度。结果 BMP9明显诱导COX-2表达,抑制COX-2酶活性或沉默COX-2均抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加。沉默COX-2明显抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞表达Runx2和Dlx-5,以及BMP9诱导的C3H10T1/2细胞异位成骨。沉默COX-2抑制BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性,降低Smad1/5/8的磷酸化水平,以及抑制Smad6和Smad7的mRNA表达。结论 COX-2对BMP9诱导MSCs成骨分化具有重要调节作用,其机制可能与COX-2调节BMPs/Smads信号转导有关。     

骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化与Wnt11的关系

目的探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导干细胞骨向分化与Wnt11的关系及可能的分子机制。方法通过q PCR、组织化学染色及Western blot等方法,检测成骨分化相关标志物,以及BMP/Smad和p38 MAPK信号的变化;利用荧光素酶报告质粒,检测BMP/Smad信号的活性改变。结果BMP9增加C3H10T1/2细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积、骨桥素(OPN)和Wnt11表达。Wnt11在C3H10T1/2、MEFs、MC3T3-E1和C2C12细胞中均有表达。在C3H10T1/2细胞中,Wnt11增强BMP9促进ALP活性、钙盐沉积、Runx-2和OPN表达的作用,以及BMP9对BMP/Smad报告质粒转录活性和Smad1/5/8磷酸化的促进作用;Wnt11还增强BMP9诱导p38 MAPK磷酸化的作用;抑制p38 MAPK则减弱BMP9诱导ALP活性、钙盐沉积及OPN表达的作用,但该效应能被Wnt11部分逆转。结论 BMP9在MSCs中能上调Wnt11表达。Wnt11能促进BMP9的骨向分化诱导作用,该作用可能与其增加BMP/Smad和p38 MAPK信号的活性有关。     

Wnt10b与骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的关系

目的研究Wnt10b与骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)骨向分化的关系,以及相关的分子机制。方法利用PCR、Western blot、组织化学染色等方法,检测BMP9对Wnt10b表达的影响,以及Wnt10b对BMP9诱导的成骨分化的影响。同时,通过定量PCR、Western blot、油红O染色、流式细胞术等,分析Wnt10b影响BMP9成骨分化诱导作用的可能机制。结果 Wnt10b在C3H10T1/2、C2C12、MEFs和MC3T3-E1细胞中均有表达,BMP9在C3H10T1/2细胞中上调Wnt10b的表达水平。Wnt10b增强BMP9在C3H10T1/2细胞中增加OCN蛋白水平和促进钙盐沉积的能力,沉默Wnt10b减弱BMP9的作用。Wnt10b并不改变BMP9对细胞周期的影响,但能增强BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化,沉默Wnt10b减弱BMP9对Smad1/5/8磷酸化的促进作用。此外,Wnt10b抑制BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导的成脂分化,沉默Wnt10b则促进BMP9的成脂分化诱导作用。结论 Wnt10b可以促进BMP9诱导的MSCs骨向分化,这种作用可能与增强BMP/Smad信号转导有关。     

骨形态蛋白9诱导干细胞骨向分化与环氧酶-2及PI3K/Akt的关系研究

目的研究骨形态蛋白9(BMP9)诱导干细胞成骨分化过程中对PI3K/Akt信号的激活与环氧酶-2(COX-2)的关系。方法利用组织化学染色法、化学发光法或定量PCR检测碱性磷酸酶(ALP)的水平,Western blot检测骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、COX-2、Akt1/2和磷酸化Akt1/2(pAkt1/2)水平,RT-PCR检测COX-2的表达,用免疫组化或免疫荧光分别检测COX-2的表达水平以及Akt1/2的磷酸化水平,用茜素红染色检测钙盐沉积。结果 BMP9在C2C12细胞中明显增加ALP活性,促进OPN和OCN表达以及钙盐沉积;BMP9对Akt1/2总蛋白无明显影响,能明显增加Akt1/2磷酸化水平,PI3K抑制剂呈浓度依赖性减弱BMP9诱导ALP活性增加。BMP9在C2C12细胞中促进COX-2表达,抑制COX-2明显减弱BMP9在C2C12细胞中诱导ALP活性增加和钙盐沉积的作用。外源性过表达COX-2促进BMP9诱导p-Akt1/2水平增加,而抑制COX-2则明显减弱BMP9诱导Akt1/2磷酸化水平增加。结论 BMP9在诱导干细胞成骨化过程中对PI3K/Akt信号的激活可能与其促进COX-2表达有关。     

过表达组蛋白去甲基化酶Jmjd3对成骨分化的调控作用

目的 研究过表达组蛋白去甲基化酶Jmjd3对间充质干细胞成骨分化的调控作用.方法 建立通过骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)诱导的间充质细胞系C3H10T1/2成骨分化模型;通过荧光定量PCR检测成骨分化转录因子,成骨细胞标记基因的表达;通过碱性磷酸酶活性测定其表达量;通过基因克隆构建Jmjd3的过表达载体,并转染到C3H10T1/2细胞实现过表达;通过免疫印迹方法鉴定蛋白质水平;通过荧光素酶报告基因测定Jmjd3对Runx2和Osx基因的转录调控.结果 BMP-2促进C3H10T1/2细胞内Jmjd3的表达;过表达Jmjd3促进碱性磷酸酶活性,以及成骨分化标记基因COLⅠ,Ocn,Bsp的表达;同时,过表达Jmjd3促进成骨转录因子基因Runx2和Osx的转录,进而促进其基因表达.结论 过表达组蛋白去甲基化酶Jmjd3对间充质干细胞的成骨分化有重要的正向促进作用.     

BMP2转基因载体的构建及在大肠杆菌DH-5α中的诱导表达

BMP2基因来源于pSP6-BMP2质粒，用pcDNA3作载体，构建BMP2转基因载体并在大肠杆菌DH-5α中的诱导表达。用HindIII与XbaI双酶切pSP6-BMP2与pcDNA3质粒，回收BMP2基因片段与pcDNA3载体，用连接酶连接后转化JM109，提质粒后酶切鉴定；把构建好的载体转化DH-5α细菌，并诱导表达，用SDS-PAGE电泳鉴定有无表达，用Western Blot鉴定表达蛋白。PcDNA3-BMP2载体酶切鉴定与预期片段相符，SDS-PAGE显示有BMP2蛋白表达；Western Blot证明表达蛋白有免疫原活性。成功地构建了表明pcDNA3-BMP2转基因载体并在大肠杆菌DH-5α中诱导表达了BMP蛋白。     

美洛昔康对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化的抑制作用

目的 探讨美洛昔康对骨形态发生蛋白9(BMP 9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响。方法 用BMP 9编码序列的重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,并同时加入美洛昔康5, 10和20 μmol·L^-1对BMP9的作用进行干预。采用化学发光法检测第5天、第7天和第9天的碱性磷酸酶(ALP)活性, RT-PCR方法分别于第9天和第11天检测骨钙蛋白mRNA表达以及第1天、第3天和第5天Dlx-5 mRNA表达, 于第14天和第20天采用茜素红S染色法检测钙盐沉积。另用荧光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号的转录活性。结果 与正常C3H10T1/2细胞组相比,第5~第9天BMP9组ALP活性明显增加(P<0.01),但加入美洛昔康5, 10和20 μmol·L^-1后,ALP活性随美洛昔康浓度增加而明显降低(P<0.05)。与正常C3H10T1/2细胞组相比,BMP9组骨钙蛋白素和Dlx-5 的mRNA表达水平及钙盐沉积明显增加,美洛昔康则明显抑制BMP9诱导的骨钙蛋白素和Dlx-5 mRNA的表达及钙盐沉积(P<0.05)。BMP9促进C3H10T1/2细胞中BMPR-Smad报告质粒的荧光素酶活性增加(P<0.01), 美洛昔康能够抑制BMP9对BMP-Smad信号的活化作用(P<0.05)。结论 美洛昔康对BMP9诱导的间充质干细胞成骨化有明显的抑制作用,其机制可能与抑制BMP-Smad信号激活有关。     

BMP调控成骨细胞生物活性的实验研究

目的 探讨骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）对培养的正常人成骨细胞主要生物学行为的影响。方法分别以0．02、0．1、1μg/m3种浓度的BMP作用于成骨细胞,通过MTY法了解BMP的效应。以0．1μg/ml浓度的BMP作用于成骨细胞,测定BMP对成骨细胞碱性磷酸酶（alkaline phospbatase,ALP）活性及骨钙素（bone gla protein,BGP）合成等主要生物学特性的影响。结果BMP作用于成骨细胞,能促进ALP活性及BGP的合成。结论BMP能促进成骨细胞活性,并且其促进成骨增殖的效能具有浓度依赖性。     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

黄连素对高糖环境下成骨细胞MC3T3-E1的影响

目的:研究黄连素在高糖环境下对成骨细胞MC3T3-E1的影响作用。方法:建立体外细胞高糖培养环境,用黄连素进行干预,通过碱性磷酸酶试剂盒分别检测细胞内和细胞分泌的ALP水平;通过实时荧光定量PCR技术检测成骨细胞相关矿化基因RUNX2、ALP、OCN、COL-1的mRNA表达量。结果:高糖显著抑制了细胞的ALP活性和分泌;黄连素干预促进了成骨细胞ALP的活性和分泌,并可以显著提高成骨细胞相关矿化基因RUNX2、 ALP、 OCN、COL-1的mRNA表达量。结论:黄连素对高糖环境下的成骨细胞的ALP分泌和成骨相关基因的表达有显著促进作用,可逆转高糖导致的细胞成骨能力的降低。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆与真核细胞表达的研究

目的 为研究慢性粒细胞白血病(CML)的肿瘤基因疫苗，克隆和表达CML的bcr—abl融合基因片段。方法 根据bcr—abl(b3a2)融合基因序列自行设计一对寡核苷酸引物，以CML K562细胞株的总RNA为模板，通过RT—PCR扩增包含bcr-abl融合位点周围450bp的基因片段，并将其克隆进pGEM—T easy载体。经序列测定证实其阅读框架正确后，将bcr—abl融合基因片段正向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1。以脂质体介导重组质粒pcDNAbcr—abl转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，用间接免疫荧光法(IFA)检测基因表达情况。结果 成功构建了包含融合位点基因片段的bcr—abl融合基因真核细胞表达载体pcDNAbcr—abl，pcDNAbcr—abl转染的CHO细胞的免疫荧光强度高于K562阳性对照细胞。结论 bcr—abl融合基因片段在真核细胞中能高效表达，pcDNAbcr—abl真核细胞表达载体的构建为进一步研究bcr—abl融合基因在CML防治中的作用奠定了基础。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白核酸疫苗的构建及免疫观察

目的：构建用于防治单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）引起的生殖器疱疹的DNA疫苗。并探讨其免疫保护作用。方法：利用PCR法从HSV-Ⅱ Say株中扩增出gD糖蛋白基因的全部编码序列，将其插入pcDNA3中，构建HSV-Ⅱ gD核酸疫苗，用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定；将重组质粒转染COS-7细胞，用原位ELISA检测表达产物；对BALB／c小鼠进行肌肉免疫，用微量细胞中和试验、ELISA、脾T淋巴细胞增殖反应和病毒攻击试验检测免疫效果。结果：构建的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗具有良好的免疫原性，对小鼠具有保护作用。结论：本实验成功构建出了具有免疫防御效应的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌Ag85B真核表达质粒并表达。方法：从结核分枝杆菌（H37Rv）基因组中扩增出Ag85B编码基因，经限制性内切酶消化后，定向克隆入pcDNA3.1( )中。采用脂质体法将pcDNA/Ag85B转染COS－7细胞，采用RT－PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出Ag85B基因，经双向DNA序列测定，与Genbank注泵的序列一致；重组质粒转染COS－7细胞后经检测证实，该基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了pcDNA/Ag85B质粒，其在真核细胞中表达的蛋白具有良好的抗原性。     

真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究#br#

目的　构建含可诱导共刺激分子（ICOS）融合蛋白（ICOSIg）基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）中表达。方法　克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1（+）/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果　经测序鉴定验证pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论　ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。