视网膜母细胞瘤动物模型的制作探讨

目的 建立兔和裸小鼠前房内视网膜母细胞瘤(Rb)移植瘤模型,对比两组之间的成功率.方法 将Y79细胞制成细胞悬液,A组注入10只兔(10眼)的前房,每眼注0.1ml;B组注入10只裸小鼠(10眼)的前房.每眼注0.4μl.结果 A组有2眼形成了移植瘤,B组均形成了移植瘤,移植瘤对NSE呈阳性反应,对GFAP呈阴性反应.结论 裸小鼠比兔更适合作为Rb细胞前房移植瘤的动物模型.     

视网膜母细胞瘤基因对视网膜母细胞瘤移植瘤细胞周期的影响

目的 观察外源性视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)移植瘤细胞周期的影响。 方法 在建立裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤模型及构建Rb基因的逆转录病毒表达载体PBabe-Rb的基础上,用脂质体Dosper介导法将Rb基因导入裸鼠RB移植瘤,流式细胞仪检测RB移植瘤细胞周期变化。 结果 Rb基因在RB移植瘤内的表达使RB移植瘤G₁期细胞数明显增加,DNA指数及S期百分比值有所降低。 结论 外源性Rb基因可部分抑制RB移植瘤细胞周期的进程。（中华眼底病杂志,2000,16：1-70）     

同种异体小鼠眼内移植性黑色素瘤模型的建立

目的 建立同种异体小鼠眼内黑色素瘤 模型，并观察其基本病理特征。 方法 昆明小鼠共36只，分为前房组、玻璃体腔组和足背皮下组，每组各12只。分别接种黑色素瘤B16F10细胞于小鼠右眼前房、右眼玻璃体腔或右足背皮下，然后对肿瘤的发生率、肿瘤眼溃破时间及瘤体的基本病理特征等进行连续32 d的观察，并作统计学分析。最后作小鼠肿瘤相关器官的病理解剖及组织切片观察。 结果 昆明小鼠移植性黑色素瘤的发生率分别为前房组12/12只眼，玻璃体腔组11/11只眼和足背皮下2/12只鼠。前2组的肿瘤发生率明显较高（χ2=17.143, P＝0.000；χ2=16.218, P=0.000）。前房组移植瘤比玻璃体腔组较早溃破眼球 (Log Rank =18.22, P=0.000)，其后肿瘤在眶内生长时均可见有被排斥而脱落的现象。32 d后，玻璃体腔组移植瘤平均直径较足背皮下组大(t=3.322，P=0.003)。在肿瘤切片观察中，眼内肿瘤未见坏死灶，而皮下肿瘤中央可见有大片坏死灶。 结论 该模型的建立方法简便, 重复性好, 在一定程度上可模拟人类眼内黑色素瘤的生物学行为, 为进一步研究其发生与发展机制提供了一种模型。 （中华眼底病杂志，2003，19：333-404）     

裸鼠视网膜下注射HXO-Rb_（44）细胞建立视网膜母细胞瘤动物模型

目的建立一种生物学行为更接近临床的视网膜母细胞瘤（Rb）动物模型。方法 Rb细胞取HXO-Rb44细胞系,培养于含质量分数10%胎牛血清的改良型RPMI-1640培养基内,细胞悬液密度调至（5.0～6.0）×106/mL备用。30只裸鼠,分为视网膜下组和玻璃体腔组,每组各15只鼠30只眼。2组注射HXO-Rb44细胞悬液后每天裂隙灯下观察裸鼠眼内Rb肿物生长情况,并于注射后21、28、35、42d,根据组织病理学检查统计成瘤情况,比较2组成瘤率。行Rb特异性标志神经元特异性烯醇酶（NSE）及酸性钙结合蛋白（S100）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学检测。结果视网膜下组和玻璃体腔组在注射后均观察到肿瘤在裸鼠眼内生长并逐渐增大。注射后21、28、35、42d,视网膜下组成瘤率高于玻璃体腔组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。免疫组织化学染色提示,Rb细胞质NSE表达较强,S100表达较弱,GFAP表达最弱。结论在同等条件下建立Rb动物模型,视网膜下注射的成瘤率高于玻璃体腔内注射者,且视网膜下注射建立的是原位肿瘤模型,生物学行为更接近临床。     

视网膜母细胞瘤裸小鼠移植瘤中细胞增生凋亡及相关基因的表达

目的研究视网膜母细胞瘤(RB)细胞的增殖与凋亡平衡的改变及其细胞凋亡的分子调控机制.方法应用细胞凋亡原位检测及免疫组织化学法检测20例裸小鼠玻璃体腔RB移植瘤中细胞增生指数(PI),细胞凋亡指数(AI)及其比值;凋亡相关基因p53,bcl-2,bax,c-myc的表达状况及与AI的关系.结果RB移植瘤PI为48.32,AI为3.92,与对照组相比差异显著(P＜0.01).RB移植瘤AI/PI为0.081,与对照组相比差异显著(P＜0.01).RB移植瘤中p53,bcl-2,bax及c-myc蛋白表达阳性细胞数分别为45.32±0.18,＜10%,40.32±0.15,45.76±0.27.AI与bax表达正相关,与p53,c-myc表达无关.结论RB移植瘤细胞增殖的增加和细胞凋亡的抑制共同参与了RB移植瘤的发生和发展过程.RB移植瘤中的细胞凋亡是p53非依赖性的由bax的过表达所致.突变型p53蛋白所致的凋亡抑制及其抑制c-myc表达所致的细胞凋亡效应,可能是RB移植瘤中细胞凋亡受抑制的分子调控机制.     

视网膜母细胞瘤细胞系裸小鼠异种移植瘤实验研究

利用视网膜母细胞瘤细胞系ＳＯ－Ｒｂ５０的细胞悬浮液，分别接种于裸小鼠右眼前房内及右颈背部皮下组织内，结果前房接种的７只裸小鼠均能形成眼内移植瘤，而皮下接种的７只裸小鼠只有１只形成皮下移植瘤。移植瘤的临床表现、组织形态学及免疫组织化学检查均与人类Ｒｂ相一致。文中分析了实验眼眼球突出的原因，讨论移植瘤瘤细胞分化程度不同的可能原因及建立动物移植瘤模型的重要意义。     

视网膜母细胞瘤裸小鼠移植瘤中nm23基因的 表达及意义

目的观察肿瘤转移抑制基因nm23的表达产物二磷酸核苷激酶（nucleoside diphosphat kinase,NDPK）在裸小鼠玻璃体腔视 网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）移植瘤中的表达状态,探讨nm23基因的表达产物 NDPK（nm23/NDPK）与RB的发生发展及浸润生长的相关性。方法对20例裸小鼠玻璃体RB移植瘤进行nm23／NDPK表达的免疫组织化学染色,以正常视网膜组织标本作对照,比较RB移植瘤眼内生长期（Ⅰ～Ⅲ级）及蔓延、扩展浸润期（Ⅳ ～Ⅴ级）nm23／NDPK的表达情况。结果正常视网膜组织nm23蛋 白表达阴性。20例RB移植瘤nm23／NDPK表达阳性,阳性细胞数为48．73±2．37,阳性表达率为100%;眼内生长期（Ⅰ～Ⅲ级）与蔓延、扩展浸润期（Ⅳ～Ⅴ级）　nm23/NDPK阳性表 达细胞数差异无显著性的意义(P>0.05)。结论nm23基因不具有抑制RB移植瘤蔓延浸润的功能,而是在其发生发展过程中起一定作用。(中华眼底病杂志,2001,17:47-49)     

绿色荧光蛋白标记的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型

目的 建立新型裸鼠脉络膜恶性黑色素 瘤原位移植瘤模型。 方法 利用脂质体将绿色荧光蛋白（GFP）真核表达 质粒pEGFP-N₁转入人脉络膜恶性黑色素瘤细胞（OC-1），新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。将2 μl细胞浓度为4.5×10⁷~5.5×10⁷个/ml的细胞悬液注射到麻醉后的40只裸鼠右眼视网膜下间隙，左眼不注射作为对照眼。手术后利用带荧光的体视显微镜连续观察肿瘤生长情况，分别于肿瘤生长的眼内期、眼外期及衰竭期处死动物，荧光显微镜观察裸鼠视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况，并行肿瘤组织的GFP免疫组织化学染色。 结果 手术后10~12 d肿瘤开始生长，血管扩张、扭曲，新生血管形成；手术后20~22 d肿瘤占满玻璃体腔；手术后24~26 d肿瘤生长至眼外；眼外期后，迅速进入衰竭期，衰竭期嗅球、肾、肺、肝脏有转移灶。移植瘤病理组织学表现类似于人脉络膜恶性黑色素瘤；免疫组织化学染色肿瘤细胞GFP染色阳性。 结论 以GFP基因标记的OCM-1经裸鼠视网膜下间隙移植建立的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型，为研究自然状态下肿瘤的生长和转移提供了一个新的方法。 （中华眼底病杂志，2004，20：245-248）     

视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞NOD-SCID鼠皮下异位移植全身转移瘤模型的建立

目的：建立人视网膜母细胞瘤（RB）的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficent）小鼠（NOD-SCID鼠）皮下移植模型,并探讨RB转移的发生、分布规律。方法：NOD-SCID小鼠皮下接种人视网膜母细胞SO-RB50细胞,定期观察小鼠的行为及肿瘤的形成、生长、转移。采用HE,免疫组织化学染色方法,对皮下肿瘤原发灶及远处转移灶行病理组织学研究。结果：皮下接种小鼠肿瘤生长的潜伏期为12-19d,成瘤为100％,5只鼠有远处转移灶,发生转移的时间在32d后,时间分布不一,肿瘤转移灶主要分布在腹腔和肾旁,小鼠的异种移植瘤和转移灶组织形态上与人类的RB一致,光镜下细胞胞质少、核深染、可见病理性核分裂,为未分化型。结论：NOD-SCID小鼠的荷瘤人视网膜母细胞瘤模型,成瘤率高,成瘤潜伏期短,较高转移率的特点。     

大鼠视神经损伤后移植人胚胎神经干细胞的实验研究

目的 探讨异种神经干细胞注射到玻璃体腔后迁移到视网膜的存活及分化，为进一步研究重建视觉传导通路奠定基础。方法在近SD大鼠眼球后壁夹住视神经根部5min，造成视神经损伤，将起源于人胚胎大脑海马的神经干细胞悬浮液注射到SD大鼠的玻璃体腔中。移植的神经干细胞预先用荧光染料Hoechst标记。分别于手术后不同的时间处死，剥离出视网膜，进行免疫组织化学染色，在荧光显微镜下观察实验结果。结果宿主视网膜在荧光显微镜下可见Hoechst标记阳性的移植细胞，移植前移植细胞神经胶质原纤维酸蛋白（GFAP）阳性表达的，移植后为阴性表达。结论视神经损伤大鼠的玻璃体腔内注射起源于人胚胎大脑海马的神经干细胞，移植细胞可以迁移到视网膜组织中存活。     

绿色荧光蛋白标记的视网膜母细胞瘤原位移植瘤模型

目的　应用绿色荧光蛋白 (GFP)基因标记人类视网膜母细胞瘤 (RB)细胞 ,建立新型裸鼠原位移植瘤模型 ,探讨RB的生长和转移特征。方法　利用脂质体将GFP真核表达质粒pEGFP N1转入人类RB细胞 (HXO RB44) ,新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。 30(6 0只眼 )裸鼠每只眼视网膜下腔均注入 2 μl细胞密度为 (4 5～ 5 5 )× 10 8个细胞 /ml的RB细胞悬液。术后利用带荧光的体视镜连续观察肿瘤生长情况 ,于不同时间点处死动物 ,荧光显微镜观察视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况。结果　术后 34～ 37d可观察到肿瘤生长至眼外 ,并可观察到肿瘤沿视神经向颅内转移 ,肿瘤细胞沿视神经鞘、睫状后长动脉浸润生长 ;移植瘤病理组织学表现类似于人类RB肿瘤 ;免疫组化染色肿瘤细胞GFP呈阳性表达。结论　经GFP基因标记的人类RB细胞裸鼠视网膜下腔移植建立的RB移植瘤模型 ,为研究自然状态下RB肿瘤的生长和转移提供了新的工具。     

胚胎干细胞在裸鼠眼内向神经元和视网膜样结构分化

目的 研究小鼠胚胎干细胞在裸鼠眼内的生长特性。 方法 将未分化的胚胎干细胞移植到Balb/c裸小鼠眼内。14～20 d处死裸鼠,观察其形态学和免疫组织化学变化。 结果 胚胎干细胞移植到裸鼠眼内,在眼前房和玻璃体腔内能见到黄白色物,逐渐增大。光镜检查：在前房和玻璃体腔内均能见到未分化细胞和已分化的细胞,部分细胞的形态和排列方式与视网膜组织中的一些结构相似,其免疫组织化学抗神经元特异性烯醇化酶染色大部分已分化细胞呈强阳性反应。 结论 胚胎干细胞在裸小鼠眼内的特定环境中,向神经元和视网膜样结构分化。（中华眼底病杂志,2000,16：213-284）     

Pluripotent Embryonic Stem Cells Developed into Medulloepithelioma in Nude Mice Eyes

Purpose:The pluripotent embryonic stem cells can differentiate into various kinds of normal tissues.There is no previous preport on the differentiation of embryonic stem cell in the intraocular environment .In this paper,the authors tried to investigate the intraocular growth character of mice embryonic stem cells in nude mice.Methods:Murine embryonic stem cells were cultured and maintained in anundifferentiated state in vitro.They were transplanted into the right eyes of 20 nude mice by microinjection under operating microscope.Animal eye observation,light microscope and immunohistochemical examinations were implemented.Results:Two to three days after transplantation,Small pieces of gray-white material could be viewed in the vitreous cavity.Between the 15th and 20th day,the gray-white mage grew into the anterior chamber in 4 nude mice eyes.Then,the mass at the anterior chamber extended extraocularly.On the 30th day,a remarkable proptosis was observed in two of the four nude mice.In 6 to 45 days,the mice were exeuted for morphological examination which showed the following typical structures:(1) Undifferentiated cells with prominent nucleolius.(2) Flexner-Wintersteiner-like rosettes.(3) Medulloepithe-liome-like structure:the cells were arranged in sheets,cords,tubes,and cysts.(4)Large,spindle-or astrocyte-like cells.(5) Cartilage-like structure,Immunohistochemically,most of the cells were highly positive in NSE staining and a few cells were moderately positive in GFAP staining.Conclusions:Both animal eye findings and morphologic examinations certificated that the transplanted embryonic stem cells could grow in the eyes of nude mice and dofferentiate into intraocular medulloepithelima.     

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Neurons and Retina—like Structure in Nude Mice

Purpose: To investigate the intraocular growth and biological characteristics of mice embryonic stem cells in nude mice.Methods: Murine embryonic stem cells (D3 cell line) were cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro, then transplanted into the anterior chamber of nude mice. Mophological and immunohistochemical examinations were implemented. Results: Two to three days after transplantation, yellow-white floating granules, sheets and masses were seen inside the anterior chamber and vitreous cavity, and enlarged gradually. 14 - 20 days later, the mice were executed. Morphological examination showed that there were undifferentiated cells and some round or polygonal differentiated cells in anterior chamber and vitreous cavity. The morphology of these differentiated cells were similar to that of the retina. The cells were highly positive in NSE staining. Conclusion: The tranplanted embryonic stem cells could grow in the eyes of nude mice with tendency to differentiate into neurons and r     

改良Wies法治疗退行性下睑内翻的一年疗效

目的 探讨改良Wies法治疗退行性下睑内翻的疗效。设计 回顾性病例系列。研究对象 北京同仁医院眼科中心27例（31眼）退行性下睑内翻患者。方法 27例（31眼）均采用改良Wies法（横行切透下睑,将下睑缩肌前徙固定于皮肤及睑板）。观察术前术后患者眼睑形态、睑缘位置等,随访（14.6±3.5）个月（12~17个月）。主要指标 眼睑形态、睑缘位置、有无溢泪。结果 术前1例复发患者,在术后14个月,双眼再次内翻复发。其余26例患者,在随访期间均未见过矫或复发,睑缘位置形态好,无不适主诉。结论 改良Wies法简单快速易重复效果好,对于治疗退行性下睑内翻建议优先考虑。     

电穿孔介导质粒DNA导入视网膜母细胞瘤抑制肿瘤生长的实验研究

目的探讨电穿孔方法介导编码可溶性血管内皮细胞膜受体sFlk1和ExTek的真核表达质粒肿瘤内转移对视网膜母细胞瘤(RB)移植瘤生长的治疗效果及其作用机制。方法通过体内、外实验证实sFlk1和ExTek对RB的抑制作用及其机制。(1)体外实验:以阳离子脂质体介导质粒pCIsFlk1转染人胚肾293细胞24h后收集细胞培养液,分别按1∶1、2∶1、3∶1的比例与RPMI1640培养基混合,补充胎牛血清至浓度为10%,培养RB细胞并绘制细胞生长曲线。(2)体内实验:将1×107个人RB细胞(HXORb44)悬液接种至40只裸鼠右后腿皮下,建立RB移植瘤模型。治疗组将电穿孔技术介导表达质粒pCIsFlk1(15μg)和pCIExTek(15μg)联合导入瘤体后电击,对照组注射生理盐水后电击。每周1次,连续3次。从第1次治疗开始至第3次治疗后1周,期间每周测量肿瘤体积2次,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率。采用抗平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学染色法确定治疗组和对照组肿瘤内微血管密度和肿瘤内血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体Flk1的表达。结果sFlk1对体外培养的RB细胞的生长无明显抑制作用。但在体内sFlk1和ExTek联合应用能够显著抑制RB移植瘤的生长,抑瘤率为80.04%。治疗组平均微血管密度为(26.69±2.95)个/200倍视野,明显低于对照组(44.51±6.11)个/200倍视野,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。尽管2组间VEGF染色强度无明显差别,但治疗组Flk1的染色强度高于对照组。结论电穿孔方法介导编码可溶性血管内皮细胞膜受体sFlk1和ExTek的表达质粒导入RB肿瘤,可明显抑制肿瘤的生长,其作用机制为抑制肿瘤血管的生成。