黄病毒属非结构蛋白5的研究进展

非结构蛋白5(NS5)作为黄病毒属中最保守的非结构蛋白,具有甲基转移酶活性和RNA依赖的RNA聚合酶活性,在病毒RNA复制过程中发挥着至关重要的作用。深入研究发现不同种黄病毒的NS5蛋白还能与宿主细胞的功能蛋白相互作用,通过不同的作用机制介导病毒的免疫逃逸。该文概述了NS5蛋白的结构、亚细胞定位及其功能,并阐述NS5蛋白在病毒复制及介导病毒免疫逃逸领域的机制研究以及靶向NS5蛋白的小分子抑制剂的研究进展。     

虫媒黄病毒基因组复制的分子机制研究进展

虫媒黄病毒包括多种重要的可导致人类疾病的病原体.对其基因组复制的分子机制的研究一直是此类病毒致病机制研究的重点.本文着重介绍病毒基因组末端与其复制相关的调控元件、病毒非结构蛋白及宿主蛋白在虫媒黄病毒基因组复制中的作用.     

虫媒黄病毒包膜E蛋白的研究进展

虫媒黄病毒包膜蛋白是黄病毒主要的结构蛋白和保护性抗原，对其结构与功能的研究，有助于了解黄病毒与其宿主细胞间的相互作用和致病的分子机制，为黄病毒病的特异性诊断、疫苗研究和抗病毒药物的设计提供理论依据。本文对近年来国内外虫媒黄病毒包膜蛋白的研究进展作一综述。     

黄病毒衣壳蛋白研究进展

黄病毒科病毒是一类单股正链RNA病毒,其基因组包含一个长的开放读码框.编码约含3 400个氨基酸残基的聚蛋白分子.聚蛋白经蛋白酶剪切加工得到衣壳(capsid,C)蛋白、prM蛋白和包膜E蛋白三种结构蛋白以及至少7种非结构蛋白.黄病毒的衣壳蛋白是病毒颗粒的构成成分之一,以多拷贝的形式与单拷贝的病毒基因组RNA共同构成病毒的核衣壳结构.近年来对C蛋白的研究取得了一定进展,已发现其除形成核衣壳结构外,还具有其他功能,这些功能涉及病毒RNA复制、病毒与宿主的相互作用等方面.本文综述了C蛋白结构与功能研究的最新进展.     

登革病毒的感染及复制研究进展

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属,是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒。其包膜蛋白E与细胞受体的结合介导病毒进入细胞,随后在感染细胞浆内复制。随着对非结构蛋白的深入研究,发现NS1、NS2A、NS3、NS4A及NS5蛋白均参与了病毒复制合体的形成,在成熟病毒颗粒的最终形成过程中,需要NS2B／NS3蛋白酶对C蛋白前体的切割及缩主细胞的糖基转移酶对prM、E蛋白糖侧链的正确加工。本文综述了登革病毒受体、病毒的复制及装配过程等方面的最新研究进展。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

蓝舌病病毒蛋白结构与疫苗研究进展

蓝舌病(Bluetongue,BT)是世界动物卫生组织(0IE)规为的多种动物共患疫病,严重危害着全球畜牧业的经济发展,接种疫苗能有效的预防该病。蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)属于呼肠孤病毒科环状病毒属,该病毒通过媒介昆虫(库蠓)叮咬牛、羊、鹿等易感反刍动物进行传播,可引起易感动物的出血性传染性疾病。BTV的10个双股RNA基因片段编码7种结构蛋白(VP1~VP7)和5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3α和NS4)。其中BTV双层蛋白衣壳中,外壳蛋白VP2和VP5是BTV型特异性抗原,内壳蛋白VP3和VP7含有BTV群特异性抗原决定簇。本文概述与总结了上述蛋白的结构、功能与研究情况和对目前国内外BT弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒及重组疫苗的研究进展。     

西尼罗病毒Chin-01株5''非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究

目的 研究西尼罗病毒Chin-01株5'非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据.方法 通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5'UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性.结果 5'UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低.第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合.同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低.结论 Chin-01株5'UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点.     

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。     

1999年新分离的登革病毒福建株基因组非编码区的结构特征

目的：测定和分析我国登革2型病毒福建株（FJ－11）基因组非编码区（NCR）序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据。方法：从登革2型病毒感染C6／36细胞中提总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5′和3′端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定,利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测。结果与结论：我国登革2型病毒FJ－11株基因组5′和3′非编码区长度分别为96nt和454nt,具有黄病毒共有保守序列和二有结构。与登革2型病毒美洲基因型比较显示,5′NCR第69位核苷酸的改变对其二级结构有影响,3′NCR端约70nt能形成相同的保守结构,而前380nt呈现多处核苷酸的差异而导致峡谷者预测的二级结构差异较大,它们可能对病毒基因组RNA的复制起重要作用。     

森林脑炎病毒(TBEV)实时定量TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立快速检测TBEV的实时定量TaqMan PCR方法。方法根据GenBank发表的TBEV全基因组序列资料,在其C基因和NS5基因区段设计TBEV的特异探针和引物,在E基因区段设计普通PCR引物。以MDJ01株作为待检毒株,黄病毒属的另外7株病毒用来评价检测体系的特异性。测定病毒的TCID50值并制备病毒拷贝数标准品,分别用于制作病毒滴度和拷贝数标准曲线。与常规PCR方法进行了灵敏度比较,并建立了病毒感染小鼠的检测模型。结果该检测方法的灵敏度可达到100拷贝／反应或0．1TCID50,是常规PCR方法的十倍。作为对照的黄热病毒疫苗株17D、登革1～4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒Chin-01株结果均为阴性,证明该体系具有良好的特异性。经过多批次、不同浓度样品的重复检测,批内和批间变异系数均小于5％,表明该体系具有较好的稳定性和重复性。结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的TBEV的TaqMan实时定量PCR检测方法,为TBEV的预防控制和诊断提供了一种技术手段。     

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区（UTR）中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。     

Unexpected death due to dengue virus infection in a non-endemic area

Dengue viral infections are increasing in number globally as more travellers are being exposed to the vector in endemic areas. A 41-year-old previously-well woman is reported who died suddenly and unexpectedly from dengue fever following a holiday overseas. Clinical manifestations prior to her collapse were non-specific, consisting of headaches, fever and diarrhoea. The autopsy findings were also non-specific with no skin rash or evidence of coagulopathy. A rapid immunodiffusion assay for dengue NS1 antigen, however, gave a rapid and strong reaction on two occasions and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) testing on a post-mortem blood sample confirmed the presence of flavivirus RNA identified as dengue type 1. This case demonstrates the possibility of serious dengue infections being associated with recent international travel. The non-specificity of symptoms, signs and autopsy findings, combined with its occurrence in non-endemic areas, makes a heightened awareness of this condition important in contemporary forensic settings.     

登革2型病毒NS5蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的 :构建登革 2型病毒 (DEN_2 )NS5表达体系 ,摸索适宜的诱导表达条件 ,克服大分子蛋白难以表达的瓶颈 ,获得DEN2_2NS5 (相对分子质量 10 4× 10 3)表达产物 ,为以后对其活性、抑制剂等方面的研究奠定基础。方法 :自DEN_2感染组织提取总RNA ,RT_PCR扩增NS5基因片段 (2 .7kb) ,插入质粒pQE30 ,转化XL1Blue大肠杆菌得表达菌株XL1Blue QENS5。同时优化诱导表达和目的蛋白的纯化条件。结果 :表达菌株XL1Blue QENS5增菌培养后更换新的培养基 ,在一定温度范围条件下诱导可以表达出最高占菌体总蛋白 2 2 .8%的NS5蛋白 ,在较低温度下诱导目的蛋白能以可溶性形式表达 ,经过纯化后的NS5蛋白纯度可达 90 %以上。结论 :在国内首次实现了DEN_2NS5蛋白的表达 ,获得的诱导表达条件可能对于其他大分子蛋白的表达有一定的借鉴意义。     

丙型、乙型肝炎病毒在人原发性肝内胆管细胞癌中分布的免疫组化研究

应用原位分子杂交及免疫组化方法，使用地高辛标记ＨＣＶ５＇非编码区探针及抗ＨＣＶＮＳ３区Ｃ３３ｃ单克隆抗体检测３５例人原发性肝内胆管细胞癌，癌旁肝组织内ＨＣＶＲＮＡ及其ＮＳ３抗原，发现ＨＣＶＲＮＡ在肝内胆管细胞癌中的阳性率为８３％。ＨＣＶＲＮＡ定位于肝细胞胞浆中，个别病例在淋巴细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞中发现阳性信号。ＨＣＶＮＳ３区Ｃ３３ｃ抗原在肝内胆管细胞癌中的阳性率为８９％，阳性反应主要位于癌细胞胞浆内或肝细胞胞浆内，阳性细胞在癌组织中以灶性分布为主，在癌旁肝组织以弥漫分布为主。ＨＢ－ｘＡｇ在本组病例的阳性率为７７％。本文结果提示，在肝内胆管细胞癌的发生中，除ＨＢＶ以外，ＨＣＶ感染与其发生也有密切关系，是其致病因素之一。     

Mx蛋白抗病毒研究进展

Mx蛋白属于大GTP酶的动态蛋白( dynamin)超家族,在体内由Ⅰ型IFN诱导.大多数的脊椎动物有1～3个不同细胞内定位的Mx蛋白异构体,一般定位于核内或胞质中.Mx蛋白具有广谱的抗病毒能力,对RNA病毒,如流感病毒、水泡性口炎病毒、托高土病毒、汉坦病毒和狂犬病毒等有作用,甚至对DNA病毒(如乙型肝炎病毒)也有一定的作用.本文论述了Mx蛋白的结构,并探讨了各个种属来源的Mx蛋白抑制不同病毒的作用及机制.     

Differential roles of RIG?I like receptors in SARS?CoV?2 infection

Retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5) sense viral RNA and activate antiviral immune responses. Herein ...     

抗登革病毒的天然免疫应答

登革热/登革出血热(DF/DHF)是热带地区最重要的蚊传播病毒性疾病,造成了非常严重的世界公共卫生问题.理解机体天然免疫应答对登革病毒感染的影响有重要意义.病毒入侵宿主细胞是感染过程的第一阶段,也是关键性的阶段,其过程所涉及的细胞蛋白鉴定与机制大部分仍然未知.间质性树突细胞(DCs)是登革病毒感染的靶细胞,也是机体天然免疫防御抗登革病毒入侵的第一道防线.在病毒感染早期.NK细胞分泌的Ⅰ型干扰素(IFN)非常重要.机体内有两个应答登革病毒感染的天然免疫通道,其中一个信号通道利用Toll样受体(TLR)家族成员,探测经细胞内吞作用进入的内涵体病毒,通过信号蛋白诱导IFN产生,并最终活化NF-κB,IRF7、IRF5等转录因子,另一个抗病毒通道则以维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)作为细胞内识别病毒dsRNA的受体.但RNAi天然免疫通道在人类是否存在还有待进一步研究.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。