兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定。方法:构建pGEX-4T1-g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-g-Hoxc10蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清。用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性。结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1-g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清。Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂。     

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的 构建植原体免疫主导膜蛋白A (IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清.方法 以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定.IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90％的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1:320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清.结论 成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清.     

人胆固醇酯转运蛋白的eDNA克隆、原核表达及抗血清制备

目的:克隆人胆固醇酯转运蛋白(CETP)eDNA序列,利用大肠杆菌表达人CETP,制备兔抗人CETP的多克隆抗血清.方法:采用RT-PCR方法,将人CETP基因克隆到pET-30b( )上,构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备CETP抗血清,以ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定.结果:SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为4 h.将切胶纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶5.12×105.Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示,抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合.结论:成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗人CETP抗血清,为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础.     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

人磷脂转移蛋白的原核表达及其抗体的制备与鉴定

目的利用大肠杆菌表达人磷脂转移蛋白(PLTP),制备兔抗人PLTP的多克隆抗血清。方法采用RT-PCR技术,将人PLTP蛋白编码序列克隆入pET-30b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,切胶纯化蛋白后免疫家兔,制备PLTP抗血清。用间接ELISA法、Western blot、细胞免疫荧光检测对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果SDS-PAGE分析表明,PLTP基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株的包涵体中高效表达,最佳诱导表达时间为3h;将纯化的蛋白免疫家兔,ELISA法测定的抗血清效价为1∶256000;Western blot及细胞免疫荧光检测显示,抗血清可以与PLTP原核及真核表达蛋白特异结合。结论成功地将PLTP进行了原核表达,制备了高效价、高特异性的兔抗人PLTP抗血清,为PLTP的临床检测及其结构与功能的进一步研究提供了有力工具。     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。