Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养及鉴定

目的　探讨Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养方法 ,在形态学方面及晶体蛋白的特异性表达方面 ,对原代和第二代细胞进行鉴定。方法　在无菌条件下 ,取新生Wistar大鼠乳鼠晶体 ,解剖镜下剔除粘附的虹膜及悬韧带 ;室温条件下 ,于终浓度 0 0 8%的胰蛋白酶液中消化 5～ 10min后离心 ,用 199培养液调细胞至适当浓度 ,37℃ 5 %CO2 条件下培养 ,3～ 4d换液 1次 ;待细胞长成连续单层后 ,以 1∶2或 1∶3传代。结果　原代及第二代细胞形态呈典型的上皮细胞表型 ,从第三代起细胞形态发生了较大变化 ,提示细胞已开始分化。以Northern印渍杂交对培养细胞晶体蛋白的特异性表达进行了鉴定 ,发现原代及第二代细胞内仅存在α晶体蛋白mRNA。结论　原代和第二代细胞尚未进入分化状态 ,可用作进一步实验的材料。     

原代人尿道狭窄成纤维细胞的体外培养及鉴定

目的对原代人尿道狭窄成纤维细胞的体外培养及鉴定,了解其增殖能力及生物学特性。方法人尿道狭窄成纤维细胞通过细胞的提取、传代、冻存与复苏获得。采用倒置显微镜观察、HE染色及波形蛋白免疫染色的方法鉴定细胞。以人胚肺成纤维细胞为对照组,以原代培养人尿道狭窄成纤维细胞的第2、4代及复苏后的第2、4代为试验组,通过对比试验组与对照组的细胞生长曲线、噻唑蓝(MTT)及流式细胞仪的检测结果了解细胞的增殖能力。结果倒置显微镜观察发现试验组与对照组细胞的形态相似,细胞HE染色及波形蛋白免疫染色鉴定细胞为成纤维细胞。通过比较试验组与对照组的细胞生长曲线、MTT及流式细胞仪的检测结果,发现各组间差异无统计学意义(P0.05),表明试验组与对照组的细胞具有相似的增殖能力。结论该试验确立了人尿道狭窄成纤维细胞的原代培养。     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的：建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型，观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法：实验于2005-03／07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养：日本大耳兔20只，利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞，无血清生长因子培养基（成分：DMEM：Ham＇sF12为1：1，并加入以下激素及生长因子：10mg／L胰岛素、5mg／L转铁蛋白、20μg／L甲状腺素、0．4mg／L氢化可的松、7．5mg／L内皮细胞生长支持物、25μg／L表皮生长因子、1mmol／L-谷氨酰胺，100IU／mL青霉素，50mg／L链霉素）体外培养。②细胞纯度及鉴定：用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果：①气管上皮细胞的分离：酶低温消化加刷洗法获得的气管上皮细胞数量较多，呈圆形，较大，悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征：套皿接种细胞24h后，贴壁率约为60％，细胞增大，并进入分裂相。五六天后细胞增殖旺盛，部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长，在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃，第3周纤毛逐渐消失成遗迹，细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察：可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定：抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性，细胞达（91&;#177;3）％。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立兔气管纤毛上皮细胞的原代培养模型，具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

人支气管上皮细胞的体外培养

背景:人支气管上皮细胞培养在呼吸系统疾病研究中应用越来越广泛.目的:探索美国典型培养物保藏中心人支气管上皮细胞体外培养方法的可行性.方法:对人支气管上皮细胞培养条件进行反复摸索,最终确定应用含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养.结果与结论:实验培养的人支气管上皮细胞扁平,呈多边形,长满后呈"铺路石"样分布,经免疫组化检测发现培养的细胞表达上皮细胞标志物细胞角蛋白.在支气管扩张症患者痰液上清刺激下,细胞表达的核因子κB、肿瘤坏死因子α和白细胞介素8明显增强,证实培养的人支气管上皮细胞获得成功.提示不必拘泥于美国典型培养物保藏中心推荐的培养条件,改进的培养方法简便易行,有应用价值.     

人绒毛膜滋养层细胞的体外培养

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织，进行原代培养，胰蛋白酶消化法传代培养，光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果 原代培养滋养层细胞3h后开始贴壁，18h后全部贴壁，3天可传代，角蛋白、波形蛋白染色细胞纯度达95％以上。结论 胰蛋白酶、胶原酶消化法简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞，建立了稳定的人类绒毛膜滋养层细胞体外培养体系。     

膀胱上皮细胞的体外原代培养方法

背景:国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高。目的:分析人膀胱上皮细胞原代培养的最佳方法。方法:在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞。结果与结论:酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P<0.001)。3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性。说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法。     

人大肠癌原代培养体外药敏试验的研究

目的探讨用生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP－TCA）研究大肠癌药敏的异质性和个体化疗的可行性。方法用ATP—TCA技术检测50份大肠癌标本对16种抗癌药单药或联合用药的敏感性。结果不同标本的药物敏感性存在着明显差异，单药中最有效的药物依次为长春瑞滨、羟基喜树碱、氟尿嘧啶和紫杉醇，敏感率分别为34．1％、31．6％、27．6％和24．3％。最有效联合用药方案是氟尿嘧啶＋丝裂霉素＋阿糖胞苷，敏感率为100％（11／11份），其次是氟尿嘧啶＋顺铂＋阿霉素和健择＋顺铂。结论大肠癌对抗癌药物的敏感程度普遍较低，且存在明显异质性。试验结果与临床治疗经验比较一致，ATP－TCA可用于为大肠癌患者选择合适的化疗药物。     

原代肾上皮细胞改良培养方法

背景:目前国内对上皮细胞的研究多采用细胞株的方式,但其离体时间长,细胞易产生变异,而原代培养则与体内状态更相近,希望能为组织工程肾脏相关研究提供肾上皮细胞来源.目的:探索原代肾上皮细胞培养的条件和方法.建立一套高效快捷的原代肾上皮细胞培养方案.设计、时间及地点:单一样本观察,开放性实验,于2007-12/2008-03在武汉大学病毒学国家重点实验室分子病毒与癌研究室完成.材料:新生2-4 d SPF级雄性SD大鼠鼠婴12只.方法:取SD大鼠,切取双侧肾脏组织,将其反复剪成约1 mm×1 mm×1 mm块,加入2.5 g/L的胰酶和0.4 g/L乙二胺四乙酸,放入37℃恒温水浴箱消化,30 min后移至200目钢网过滤,去除未消化组织块和细胞团,收集网下悬液1 000 dmin低温离心5 min,用DMEM(pH 7.2)培养基制成细胞悬液,以4×108L-1密度接种于培养瓶中,置CO2培养箱中培养.再将细胞悬液接种到一个培养瓶内,静止培养30min,镜下观察细胞部分贴壁,将培养液连同尚未J贴壁细胞一起吸到另一瓶内,继续培养,重复上述操作一次,纯化肾上皮细胞.主要观察指标:以4×108L-1密度接种于培养瓶中培养.用4 g/L锥虫蓝染色榆测肾上皮细胞的存活率,不着色者为存活细胞.并观察肾上皮细胞的形态学变化、贴壁率.结果:肾上皮细胞存活率为95.20%,4 h约60%的细胞贴壁,12 h 85%以上的细胞已经贴壁.24 h后肾上皮细胞伸出伪足呈梭形、多角形,具有胞核一两个,细胞大小均匀,生长迅速,三四天后形成细胞簇,最后肾上皮细胞连接成片生长.结论:该肾上皮细胞培养方法存活率、贴壁率高,是一种可靠的肾上皮细胞培养方法.     

体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力,是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察,而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。 目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响,探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。 方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。 结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%,存在很大的个体差异。并且,随着传代次数的增加,人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低,其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外,培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异,且其差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示,不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响,需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本,以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外,体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响,需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外,人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响,在今后还需要进一步研究。     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

目的 建立稳定的人诱导性多能干细胞(iPS细胞)培养体系.方法 取第3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,丝裂霉素C处理后用作饲养层.人iPS细胞接种于饲养层上生长,胶原酶消化或机械法传代.倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态;观察拟胚体形成能力;RT-PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况.结果 (1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEn为贴壁生长细胞,呈梭形或多角形.细胞增殖旺盛.(2)生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长.克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰.克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,细胞核,质比高.RT-PCR结果 显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体(EB).结论 本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养,人iPS细胞能稳定增殖,保持自我更新及分化潜能.     

人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

目的建立稳定的人诱导性多能干细胞（iPS细胞）培养体系。方法取第3．5代的小鼠胚胎成纤维细胞．丝裂霉素C处理后用作饲养层。人iPS细胞接种于饲养层上生长,胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态：观察拟胚体形成能力;RT—PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况。结果（1）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为贴壁生长细胞,呈梭形或多角形。细胞增殖旺盛。（2）生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形．边界清晰。克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,细胞核／质比高。RT—PCR结果显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体（EB）。结论本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养,人iPS细胞能稳定增殖,保持自我更新及分化潜能。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的：探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。 方法：实验于2004-09／2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血，经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在含有体积分数为O．1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4mg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增，分别在培养的第6和14天，流式细胞仪检测其KDR，CDl33，CD34和vWF阳性率，并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞、DiI-aeLDL来进行细胞功能学的鉴定。 结果：①人外周血单个核细胞经体外诱导分化，培养第6天的贴壁细胞表达KDR，CDl33，CD34和vWF，流式细胞仪检测其阳性率分别为（46．4&;#177;9．3）％、（33．8&;#177;1l、7）％、（73．5&;#177;6、3）％和（38．9&;#177;8、2）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR，CD34和vWF，不表达CDl33，流式细胞仪检测其阳性率分别为（8l、5&;#177;7、6）％、（88．9&;#177;5．4）％和（78、3&;#177;13．6）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。 结论：外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。