人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔下颌骨牵张成骨实验的组织形态学观察

背景:如何提高牵张成骨过程中新骨形成的速度和质量,缩短牵张成骨治疗时间,减少并发症的发生是目前该领域的研究热点。目的:观察人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。方法:36只新西兰白兔随机摸球法分为3组。建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射人骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞;对照组注射等量自体骨髓间充质干细胞;空白组注射等量生理盐水。结果与结论:在固定期2周及6周实验组牵张区骨小梁形成质量明显好于对照组和空白组。证实骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

兔下颌垂直牵张骨形成中Smad1的表达

目的:观察细胞内信号转导分子Smad1在兔下颌骨垂直牵张后骨组织中的表达,探讨Smad1在新骨形成中的作用。方法:实验于2006-01/03在辽宁医学院动物实验中心完成。实验材料:健康日本大耳白兔18只,雌雄不限,体质量1.5～1.75kg。自制双螺旋种植型骨牵张器:外直径4.0mm,螺距0.75mm;内直径2.0mm,内螺距0.25mm。实验分组:根据随机排列表分为空白对照组3只(非手术)、牵张组15只,其中牵张组1d,1,2,4,6周每个时间点各3只。实验干预:①用摆动锯对兔下颌骨截骨,形成8mm×5mm骨升段,建立动物模型。②根据升骨段所在的位置安放种植牵张器,对兔下颌骨垂直牵张,1mm/d,2次/d,牵张4d。实验评估:分别于牵后第1天,1,2,4,6周取材,通过X射线及苏木精-伊红染色观察新骨形成情况,并用免疫组织化学法检测兔下颌骨垂直牵张过程中不同时期Smad1的表达与分布。结果:18只兔均进入结果分析。①X射线及组织学观察:牵张1周,牵张区呈大的透射区,骨皮质连续性中断,牵张间隙两端界面清晰可见,牵张间隙呈低密度影像,牵张间隙内新骨逐渐形成,6周时牵张区基本被成熟新生骨充填。②免疫组织化学观察,牵张结束后Smad1表达增强,阳性信号主要在间充质细胞和新生骨小梁边缘的成骨细胞表达。Smad1/5在牵张成骨中的定量分析结果,在牵张成骨1d,1,2,4,6周及空白对照组Smad1表达灰度值分别为:98.18±7.18,78.94±8.58,115.50±14.60,138.48±15.69,150.01±12.81,151.06±12.85。Smad1表达高峰在牵张后1周,以后逐渐下降,牵张后4周在骨细胞微弱表达,6周时恢复到正常水平(P>0.05)。结论:Smad1参与兔下颌骨垂直牵张新骨形成过程,并在牵张成骨的早期诱导间充质细胞分化为成骨细胞过程中可能起重要作用。     

牵张成骨增高山羊牙槽嵴动物模型建立的研究

目的:采用山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区构建牵张成骨增高牙槽嵴的动物实验模型,并研究此模型的有效性及可行性。方法:陕西关中山羊6只,选取一侧山羊下颌无牙区至下颌第一前磨牙根尖下方行矩形截骨,安装骨牵张器,间歇7d后牵张增高牙槽嵴,1次/d,1mm/次,共加力8d。分别固定4,8周后取材。行X线,临床大体和组织学观察。结果:平均牙槽嵴增高分别为7.5,7.0mm;X线片示:牵张后4周,牵张间隙已被新生骨组织所充填,新生骨较原有骨密度低。牵张后8周,新生骨密度与旧骨相同。组织学观察显示:牵张后8周有成熟的骨小梁及骨皮质形成。牵张区牙齿牙髓结构正常。结论:山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区可作为牵张成骨增高牙槽嵴新的实验动物模型。     

99Tcm-MDP骨显像监测可注射组织工程骨的成骨活性

背景:有关牵张成骨传统的新骨生长形态观察方法如超声、X 射线、CT文献报道较多,但有关核素监测的报道较少.目的:探讨经皮注射可注射组织工程骨促进牵张间隙成骨的可行性及放射性核素骨显像对其的早期监测作用.方法:将20只日本大耳白兔以随机数字表法分为实验组和对照组,两组均于右胫骨中下段造成20 mm的骨缺损,干骺端截骨.7 d后延长,1 mm/次、1次/d.造模前实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第2代后诱导成骨.延长达靶位点后,实验组牵张间隙内注射自体干细胞悬液,并同时注射自体富血小板血浆;而对照组只注射等量生理盐水.采用核素骨显像监测移植后2,4,8周时成骨情况.结果与结论:放射性骨显像99Tcm-MDP注入3 h后,实验组与对照组可见显像剂明显沉积于牵张间隙区,均较对侧健性部位显影强.骨骼、肾及膀胱显像清楚,骨/软组织的对比度清晰,各组均可见大关节及肌腱附着处有对称性放射性增高区.两组在2,4周时牵张间隙放射性聚集呈现出上升的趋势,实验组上升趋势更为显著;8周时实验组和对照组核素浓聚变弱,但两者差异仍有显著性意义(P < 0.01).结果说明经皮注射移植复合富血小板血浆的可注射组织工程骨能够促进牵张间隙成骨能力,缩短成骨时间.放射性核素骨显像在早期修复过程有比较灵敏的监测效果.     

不同时期注射富血小板血浆对牵张成骨的影响

目的确定富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)在牵张成骨中的最佳注射时期。方法将36只大白兔随机分为4组,每组9只。Ⅰ组为对照组不注射PRP,其余3组分别在延迟期、牵张期和固定期注射0.5ml PRP于牵张间隙中。牵张结束后2、4、8周每组各处死3只动物取材。双能量X线骨密度仪(dualenergy X-ray absorptionmetry,DEXA)测量新生骨骨密度,采用方差分析法对数据进行统计分析;HE染色光镜下观察新骨生成情况。结果实验组新骨生成速率高于对照组;牵张结束后2、4周时,牵张期注射PRP组骨密度测量和组织学观察与其余两实验组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论PRP对牵张成骨具有促进作用,牵张期注射PRP可缩短牵张成骨过程。     

Smad7在兔下颌骨牵张成骨过程中的表达

背景:有研究表明Smad7可结合并抑制骨形成蛋白受体的下游信号,而骨形成蛋白可促进牵张成骨过程中的骨愈合,并且Smad7对软骨形成起到抑制作用,但Smad7在牵张成骨中的作用机制尚不清楚.目的:利用种植型牵张器增高兔下颌牙槽嵴,观察下颌骨牵张成骨过程中Smad7的表达规律.方法:将雄性日本大耳白兔24只随机分为对照组4只,牵张成骨组20只,其中牵张成骨组再按牵张时间点不同再随机分为牵张成骨1 d,1,2,4和6周组,4只/组.选取牵张成骨组兔左侧下颌骨行牵张成骨,其间歇4 d,开始种植型牵张器垂直增高兔下颌牙槽嵴.各组分别于牵张成骨后1 d,1,2,4,6周取材,在牵张成骨侧下颌骨行骨密度测量,用免疫组织化学法观察兔下颌骨牵张过程中不同时期Smad7的表达和分布.结果与结论:Smad7在正常下颌骨组织中有少量表达,在牵张后1 d下颌骨中的Smad7表达高于对照组(P<0.05).牵张成骨后1,2和4周组的Smad7表达比牵张成骨后1 d组有所减少,但仍高于对照组,牵张成骨后6周时与对照组差异无显著性意义(P>0.05).牵张区下颌骨骨密度值在牵张成骨后1 d最低,1,2和4周组骨密度值相比对照组逐渐增高(P<0.01).提示Smad7在牵张成骨过程的不同时期表达不同,Smad7可能对牵张成骨早期的新骨形成起一定的促进调节作用.     

99）Tcm-MDP骨显像监测可注射组织工程骨的成骨活性

背景：有关牵张成骨传统的新骨生长形态观察方法如超声、X射线、CT文献报道较多,但有关核素监测的报道较少。目的：探讨经皮注射可注射组织工程骨促进牵张间隙成骨的可行性及放射性核素骨显像对其的早期监测作用。方法：将20只日本大耳白兔以随机数字表法分为实验组和对照组,两组均于右胫骨中下段造成20mm的骨缺损,干骺端截骨。7d后延长,1mm/次、1次/d。造模前实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第2代后诱导成骨。延长达靶位点后,实验组牵张间隙内注射自体干细胞悬液,并同时注射自体富血小板血浆;而对照组只注射等量生理盐水。采用核素骨显像监测移植后2,4,8周时成骨情况。结果与结论：放射性骨显像99Tcm-MDP注入3h后,实验组与对照组可见显像剂明显沉积于牵张间隙区,均较对侧健性部位显影强。骨骼、肾及膀胱显像清楚,骨/软组织的对比度清晰,各组均可见大关节及肌腱附着处有对称性放射性增高区。两组在2,4周时牵张间隙放射性聚集呈现出上升的趋势,实验组上升趋势更为显著;8周时实验组和对照组核素浓聚变弱,但两者差异仍有显著性意义（P〈0.01）。结果说明经皮注射移植复合富血小板血浆的可注射组织工程骨能够促进牵张间隙成骨能力,缩短成骨时间。放射性核素骨显像在早期修复过程有比较灵敏的监测效果。     

牵张成骨增高山羊牙槽嵴动物模型建立的研究

目的：采用山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区构建牵张成骨增高牙槽嵴的动物实验模型，并研究此模型的有效性及可行性。方法：陕西关中山羊6只，选取一侧山羊下颌无牙区至下颌第一前磨牙根尖下方行矩形截骨，安装骨牵张器，间歇7d后牵张增高牙槽嵴，1次／d，1mm／次，共加力8d。分别固定4，8周后取材。行X线，临床大体和组织学观察。结果：平均牙槽嵴增高分别为7．5，7．Omm；X线片示：牵张后4周，牵张间隙已被新生骨组织所充填，新生骨较原有骨密度低。牵张后8周，新生骨密度与旧骨相同。组织学观察显示：牵张后8周有成熟的骨小梁及骨皮质形成。牵张区牙齿牙髓结构正常。结论：山羊下颌无牙区及下颌第一前磨牙区可作为牵张成骨增高牙槽嵴新的实验动物模型。     

依普拉芬在牵张成骨中的作用

背景：有研究表明适宜浓度的依普拉芬可以促进鸡胚额骨成骨细胞增殖与分化,提高其碱性磷酸酶活性,增强成骨细胞矿化能力,促进骨形成。目的：观察依普拉芬在用种植型牵张器对兔下颌牵张时成骨的影响。方法：选择日本大耳白兔建立下颌骨牵张成骨动物模型,再用依普拉芬干预。于牵张后1d,1,2,4周取材,进行血清学检查,并采用免疫组织化学方法观察转化生长因子β1在不同时间段的表达情况。结果与结论：依普拉芬干预的模型兔在牵张后1d,1,2,4周的骨小梁逐渐形成,成骨细胞逐渐增多,血清碱性磷酸酶活性和转化生长因子β1的表达均增高（P〈0.05）。结果证实依普拉芬在牵张成骨中可有效加速新骨的形成。     

自体富血小板血浆促进兔上颌缝的牵张成骨

背景：富血小板血浆内含多种高浓度的生长因子，具有促进新骨生成，加速愈合的作用，对牵张成骨的作用尚无公识性结论。目的：观察自体富血小板血浆对免上颌骨牵张成骨的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于200707／08在中山大学北校区何母实验楼生理实验室完成。材料：3～5月龄健康家兔16只，雌雄各半，体质量1．4～1．7kg，随机分为实验组和对照组，每组8只。自制上切牙带环、外置式前牵引面具、牵引橡皮圈。凝结剂由1000U牛凝血酶溶于1mL100肌氯化钙制成。方法：分别在家兔左侧前颌缝的两侧置入钛钉（直径1．5ram），戴自制前牵引装置，试验组在牵张开始时，注射V（富血小板血浆）：V（凝结剂）=9：1混合的凝胶样物质至左侧前颌缝内。两组分别持续牵引1周和3周，每个时间点4只家兔。主要观察指标：牵引结束后测量骨缝两侧钛钉间距离的增加值以及组织学观察结果。结果：对照组和试验组家兔上颌均向前移位。同对照组相比，实验组骨缝标志钉间距离增加值较大，新骨生成与矿化较快，血管分布较多，牵张间隙中骨小粱较为粗壮和成熟。结论：富血小板血浆有助于骨组织再生，对兔上颌牵张成骨具有促进作用。     

下颌骨牵引成骨过程中基因干预对牵引区转化生长因子β1表达的影响

背景:局部基因治疗能促进牵引区新骨的生成,但关于基因治疗后对局部生长因子表达的影响目前尚不清楚。目的:观察电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中转化生长因子β1表达的影响。方法:新西兰大白兔双侧下颌骨截骨后3d开始下颌骨牵引,0.8mm/d,连续牵引7d后,随机分为5组,分别在牵引区注射2μg(0.1g/L)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165、空质粒pIRES及相同剂量的生理盐水。之后施加电穿孔刺激。结果与结论:免疫组织化学染色发现转化生长因子β1主要在细胞胞浆中表达,给药7d时骨端骨细胞、编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞呈转化生长因子β1染色阳性;14d时新生成的编织骨痂骨细胞、骨痂表面成骨细胞、肉芽组织中的间质细胞、单核巨细胞、多核巨细胞转化生长因子β1染色阳性;28d时转化生长因子β1阳性细胞明显减少。其中注射重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165后转化生长因子β1的表达明显多于注射空质粒pIRES及生理盐水(P<0.05或P<0.01)。说明基因治疗能促进转化生长因子β1的表达,促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成。     

Osteogenic growth peptide accelerates bone healing during distraction osteogenesis in rabbit tibia

Distraction osteogenesis is a valuable treatment method that allows limb lengthening or reconstruction of large bone defects. However, its major disadvantage is the long period required for the consolidation of a distraction callus. Osteogenic growth peptide (OGP) stimulates endochondral bone formation in fracture callus, but its capacity to promote regenerate ossification during distraction osteogenesis has not been evaluated. This study investigated whether intravenously administered OGP accelerated bone healing during distraction osteogenesis in 36 male New Zealand White rabbits, randomized into two groups. The treatment group received OGP (200 ng/kg body weight) in phosphate-buffered saline (PBS), intravenously, each day; the control group received PBS alone. A 15-mm lengthening of the right lower leg was performed using the method of Ilizarov. Evidence from biomechanical, histological and radiographic evaluations demonstrated that systemic OGP treatment promoted optimal new bone formation during distraction osteogenesis in this rabbit model.     

电穿孔介导基因治疗下颌骨牵引过程中血管内皮细胞生长因子的表达

背景:课题组前期实验已证明基因治疗能促进下颌骨牵引区新骨的生成。目的:探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中血管内皮细胞生长因子表达的影响。方法:45只新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,建立下颌骨牵引模型。牵引7d后将模型兔随机摸球法均分为pIRES-hVEGF165-hBMP2组、pIRES-hBMP2组、pIRES-hVEGF165组、空质粒载体pIRES组、生理盐水对照组,分别于牵引区注射相应质粒或生理盐水。各组动物均施加电穿孔刺激。结果与结论:血管内皮细胞生长因子主要在骨周围结缔组织成纤维细胞、血管内皮细胞、骨组织成骨细胞和骨细胞表达,也可见炎细胞如单核细胞表达。各组均在固定期第7天表达最强,14d下降,28d时表达较弱,但在各时点基因治疗组明显强于对照组。说明电穿孔介导的基因治疗能使血管内皮细胞生长因子持续表达,并使其表达时限延长,促进牵引区新生血管生成和新骨形成。     

下颌骨牵张成骨和牵张器拆除时机的评价

目的:牵张成骨是治疗颌骨畸形和骨缺损的新方法,但力学研究及由此而确立的牵张器拆除时机的研究甚少。通过建立了山羊下颌骨牵张模型,观察下颌骨牵张后的物理、机械特性,探索牵引器拆除的时间。方法:8只山羊单侧下颌骨2次/d,1mm/d,共8d,后以牵开器继续固定至4周,行放射学、组织学、骨密度及力学测试。结果:牵拉术后下颌骨成骨明显,牵拉后2周,X线示骨间隙内新骨已基本连接骨缺损,4周时骨化明显。其骨密度与正常松质骨无明显差别,极限载荷为正常侧的61%。结论:生长期山羊为一良好的下颌骨牵张模型动物,牵拉后4周可以考虑去除牵开器。     

原核表达的重组人骨形态发生蛋白7增高牙槽嵴的实验

背景:牙齿缺失后,牙槽骨内成骨与破骨的动态平衡被打破,牙槽嵴呈现出不可逆转的骨吸收,其后果是大量的牙槽骨丢失;骨形态发生蛋白在骨及牙齿的生长发育和创伤修复中发挥重要作用。目的:观察原核表达的重组人骨形态发生蛋白7对增强牙槽嵴的新骨形成、预防牙槽嵴吸收的作用。设计:对照实验。单位:济南市口腔医院正畸科,山东省医学科学院。材料:实验于2003-06/2004-12在山东省医学科学院完成,采用新西兰大白兔28只,雌雄不限,体质量平均2kg。方法:采用大白兔建立动物拔牙创模型,将大白兔分别拔除左、右下门牙,将骨形态发生蛋白7复合载体2块40μg植入右下门牙(为实验组),仅含磷酸盐缓冲液的空载体2块40μg植入左下门牙(为对照组),术后2,4,8及12周处死动物,取标本进行扫描电镜分析、钙含量及碱性磷酸酶活性测定。主要观察指标:①扫描电镜分析结果。②碱性磷酸酶活性及钙含量。结果:①电镜照片结果:实验组的骨创愈合比对照组提前4～6周。②碱性磷酸酶活性:实验组均明显高于对照组[2周:(38.191±5.384),(19.821±2.084)μkat/g;4周:(160.815±9.669),(126.709±1.634)μkat/g;8周:(378.892±13.086),(225.212±1.884)μkat/g,P<0.01]。③钙含量:实验组均明显高于对照组[2周:(5.592±0.110),(0.913±0.064)mg/g;4周:(8.654±0.177),(1.702±0.071)mg/g;8周:(25.326±0.287),(5.980±0.145)mg/g,P<0.01]。结论:原核表达重组人骨形态发生蛋白7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。     

重组人骨形态发生蛋白2对兔椎间盘成骨作用的诱导

背景:重组人骨形态发生蛋白2作为一种新药已应用于临床,但在椎间盘内诱导成骨的研究报道很少。目的:通过动物实验,观察重组人骨形态发生蛋白2对兔椎体间融合的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验多水平评估,于2003-02/07在青岛大学医学院附属医院完成。材料:24只纯种成年新西兰大白兔,体质量3.5～4.5kg,分离暴露L4～5、L5～6椎间盘;重组人骨形态发生蛋白2,1mg/支,纯度≥95%,无菌包装,购自北京市百灵克生物制品有限公司。方法:24只大白兔随机投币法分为实验组和对照组,每组12只。实验组向L4～5椎间盘的髓核中注射含200μg重组人骨形态发生蛋白2的生理盐水溶液20μL;向L5～6的髓核中注射等量的生理盐水作为自身对照;对照组动物L4～5椎间盘的髓核中注射生理盐水20μL。主要观察指标:术后10,30,60,90d应用手法检查、组织学和影像学观察注射节段的形态变化。结果:纳入新西兰大白兔24只,均进入结果分析。①实验组10dL4～5节段活动范围无明显变化;30d活动范围轻度受限;60d活动范围明显受限;90dL4～5节段皆固定。作为自身对照的L5～6节段及对照组关节活动范围无明显变化。②实验组10dL4～5椎体间隙变窄;90dL4～5椎间隙消失,椎体间形成骨性融合。对照组及作为自身对照的L5～6节段椎间隙透光度无明显改变。③实验组10d髓核细胞逐渐变小,90d部分软骨终板已转化为成熟的编织骨;纤维环的胶原纤维结构逐渐消失,10d和30d均可见大量间充质细胞在纤维环外围聚集;90d纤维环靠近软骨终板处已形成成熟的编织骨。对照组各时间点组织学形态无明显变化。结论:重组人骨形态发生蛋白2可诱导椎间盘成骨,达到椎体间融合的目的。     

重组人骨形成蛋白2对下颌骨牵引成骨中整合素β_1表达的影响

背景:骨组织中整合素表达水平可影响细胞功能,调控成骨和骨吸收,但整合索只有被其他因于激活后才能发挥强大的黏附作用,重组人骨形成蛋白2具有此作用吗?目的:观察不同质量重组人骨形成蛋白2对兔下颌骨牵引成骨区整合素B_1的表达影响.设计、时间及地点:随机分组动物实验,组织学观察,于2006-05/2007-05在辽宁医学院动物实验中心和免疫组化中心完成.材料:日本成年大耳白兔45只.重组人骨形成蛋白2由北京军事医学科学院三所八室提供.方法:选用日本成年大耳白兔45只建立下颌骨牵引模型,造模后采用随机数表法将分为3组:空白对照组、1.5,3.0 mg重组人骨形成蛋白2胶原海绵载体组,15只/组.分别将不含重组人骨形成蛋白2胶原海绵载体、含1.5,3.0 mg重组人骨形成蛋白胶原复合物植入3组兔下颌骨切开处,固定、牵引0.4 mm/次,2次/d,共计5 d,总延长下颌骨4 mm.主要观察指标:牵引后稳定期第1,3,7,14,28天取牵引区新生骨痂行免疫组织化学染色观察骨组织中整合素β_1的表达.结果:45只日本大耳白兔均建模成功,进入结果分析.整合素β_1在牵引区表达主要反映在牵引7 d后.在同一时间内,随着重组人骨形成蛋白2质量的增加,整合素β_1阳性细胞表达率、阳性面积百分比逐渐增多(P<0.05):在同一质量下,随着时间的延长,整合素β_1阳性细胞阳性表达率、阳性面积百分比逐渐上升(P<0.05).结论:局部应用外源性重组人骨形成蛋白2在牵引成骨中晚期对整合素β_1的表达有促进作用,并且整合素β_1的表达对重组人骨形成蛋白2呈质量依赖性.