C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景:获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的:比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法:贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论:随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P<0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P>0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P<0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P<0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P<0.01)。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的：比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞（P〈0.01）;细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异（P〉0.05）。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞（P〈0.01）。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞（P〈0.01）。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞（P〈0.01）。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

无血清培养体系对人类急性髓系白血病祖细胞克隆性生长的意义

无血清培养体系对人类急性髓系白血病祖细胞克隆性生长的意义唐继森，李崇渔，王辨明，刘秀芳，喻东姣，陈智超我们用支持急性髓系白血病祖细胞（ＣＦＵ－ＡＭＬ）生长的无血清培养（ＳＦＣ）体系，观察重组人红细胞生成素（ｒｈＥｐｏ）、重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子...     

人脐血树突状细胞体外无血清培养

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞,已试用于肿瘤的免疫治疗,但多数实验室培养DC的体系中包含血清,使其临床应用受到限制。本研究以人脐血为来源,建立了无血清培养DC体系,以期将来用于临床。首先,用rhGM-CSF加rhTNF-α,进行有血清液体悬浮培养,14天后,从(1±0.5)×10~4/ml CD34~ 细胞或(5±2)×10~5/ml单个核细胞中,总细胞数扩增5倍,DC分别占(25±5)％和(17±5)％。第二,以无血清培养基代替有血清培养基,培养21天,(2±1)×10~6/ml单个核细胞没有数量的扩增,DC占(7±2)％。最后,对上述培养体系,在第5天(有血清培养基)或第12天(无血清培养基)后加入rhIL-4,DC产率及细胞总数均未增加。本研究结论:①根据液体悬浮培养中观察到粒、巨噬细胞和DC的混合集落及DC小丛,证实DC与粒、巨噬细胞有共同祖先,均来源于CD34~ 造血干/祖细胞;②脐血单个核细胞虽较CD34~ 细胞产生DC的比率稍低,但分离方便,花费少;③无血清体系的培养效果不如有血清体系,培养所需时间也长,细胞产率也低,有待进一步完善;④未证实rhIL-4能增加DC产率。     

无血清体外培养树突状细胞的研究

本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞（dendritic cell，DC）的无血清培养方案。以含胎牛血清（FCS）、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMNC），在不同培养液中分别加入GM—CSF（100ng／ml）、IL-4（500U／ml）培养6天，再分别加入钙离子载体A23187（100ng／ml）继续培养24小时，于倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析细胞表型，MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明：无血清培养组培养出典型形态的DC，其表面CD14分子的表达明显减少，CD83、HLA—DR、CDw123分子的表达明显增高，具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较，组间无显著性差异（P〉0．05）。结论：无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比，无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。     

慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞活力和蛋白合成功能的影响

目的观察慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞株的影响,为研究应用C3A细胞株的生物反应器进行生物人工肝支持治疗提供实验依据。方法用100%正常人血浆(normalhumanplasma,NHP)和100%慢性重型肝炎患者的血浆(chronicseverehepatitisplasma,CSHP)培养C3A细胞,四甲基偶氮唑盐法(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)检测细胞活力,通过3H-亮氨酸掺入法检测细胞蛋白合成速率,Western-blot分析比较白蛋白合成功能,从细胞活力和蛋白合成方面研究慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞的影响。结果①连续5天检测100%CSHP培养的C3A细胞活力均明显高于100%NHP组,(t值分别为6.26、4.89、3.55、3.94、6.17,P值均小于0.01);②第48h100%CSHP培养的C3A细胞蛋白合成速率高于100%NHP组,结果差异有显著性(t=5.93,P<0.01);③培养24h后Western-Blot分析可见100%CSHP组白蛋白表达量明显高于100%NHP组。结论CSHP对C3A细胞的增殖和蛋白合成功能有促进作用。     

骨髓间充质干细胞的培养基

国内外大量实验证明,通过长期培养后获得的骨髓间充质干细胞具有非常广泛的分化潜能,形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤、软骨等。一方面说明了骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化的能力,另一方面说明在适当的培养环境     

兔结膜杯状细胞的无血清培养法

目的 探索无血清培养系统用于结膜上皮杯状细胞培养的可行性。方法 用不含血清培养液进行组织块培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,并应用特殊组化染色和免疫组化方法对培养杯状细胞进行鉴定。结果 倒置相差显微镜下可见在无血清培养液中杯状细胞形态与活体组织中相似,免疫组化法证实部分细胞PAS和MUC5AC呈阳性染色。结论 兔结膜杯状细胞可通过无血清培养法在体外培养,并保持活体细胞特性,为进一步研究杯状细胞相关的眼表疾病及药理毒理作用提供有效的细胞模型。     

无血清培养慢性粒细胞白血病树突状细胞的方法及其杀瘤效应研究

目的无血清培养慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DCs）并观察其杀瘤效应。方法小牛血清（FCS）、无血清（SFM）及自体血清分别培养CML—DCs，以SCF，GM—CSF，TNF—α，IL-4（A）与GM—CSF，TNF—α，IL-4（B）两组不同的细胞因子作对照。结果SFM同FCS培养体系相比差异无统计学意义（P〉0．05），与自体血清体系相比差异具有显著性统计学意义（P〈0．01）。CML—DCs HLA—DR高表达（〉50％），CD80，CD83舜口CD86表达比例不高（〈50％）。CML—DCs能刺激正常人T淋巴细胞增殖，但增殖倍数不高。经10～12d培养，5例CML—DCs行染色体G显带分析，含Ph染色体比例分别为100oA3例，98％及60％各1例，同培养前标本携带Ph比例基本吻合。在效靶比40：1，以CML—DCs同自身T细胞，自体Ph叶。单个核细胞（MNCs）共孵育，测其杀伤率为（38．5士6．5）％。结论建立了CML—DCs无血清培养方法。CML—DCs携带Ph染色体，能刺激自体T细胞杀伤自身白血病细胞。     

无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

背景：无血清培养对大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化影响的报道甚少。目的：观察无血清培养大鼠脂肪干细胞后向血管内皮细胞诱导分化的情况。方法：采用酶消贴壁培养法获得雄性SD大鼠脂肪干细胞,传代培养至第3代。实验组细胞无血清培养24h,对照组用含体积分数10％胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养。然后应用血管内皮细胞诱导培养基培养3周。结果与结论：大鼠脂肪干细胞经体外培养可呈多角形或梭形贴壁生长,并能稳定传代。传代后大鼠脂肪干细胞极低表达细胞表面标志CD31。大鼠脂肪干细胞定向血管内皮细胞诱导分化后细胞呈鹅卵石样,CD31阳性表达明显上升且实验组明显高于对照组。实验组诱导后大鼠脂肪干细胞能够吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白及在基质胶上形成2D小管样结构,其能力明显强于对照组。结果证实无血清培养可促进体外大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化。     

Application of a serum-free medium in the growth and differentiation of human peripheral blood lymphocytes

To eliminate variability due to nonspecific stimulation or inhibition by different lots of fetal bovine serum, the activation of human peripheral blood mononuclear cells in a modification of Iscove's medium (medium C-IMDM) was compared with the routinely used Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium containing 15% fetal bovine serum. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells was enhanced and occurred at lower mitogen concentrations in C-IMDM compared with cells grown in RPMI-1640 supplemented with fetal bovine serum. Maximum incorporation of [3H]thymidine following stimulation by concanavalin A, phytohemagglutinin, and pokeweed mitogen was more than twice the peak values obtained in RPMI-1640 supplemented with fetal bovine serum. Concentrations of concanavalin A and phytohemagglutinin required for maximum stimulation were 0.5 and 15 micrograms/ml, and 0.3 and 1.0 micrograms/ml . 5 X 10(5) cells in C-IMDM and RPMI-1640, respectively. Cells grown in C-IMDM responded to lower concentrations of pokeweed mitogen and optimal growth in the serum-free medium required 0.4 micrograms/ml . 5 X 10(5) cells. The stimulation of immunoglobulin-producing cells in C-IMDM was enhanced and occurred at lower concentrations of pokeweed mitogen. Less variability of growth (i.e., incorporation of [3H]thymidine) and immunoglobulin synthesis occurred in peripheral blood mononuclear cells cultured in different preparations of C-IMDM than that reported for cells cultured in RPMI-1640 supplemented with different lots or batches of fetal bovine serum. These data suggest that C-IMDM may be an alternative to media supplemented with fetal bovine serum.     

A clinical-scale expansion of mobilized CD 34+ hematopoietic stem and progenitor cells by use of a new serum-free medium

BACKGROUND: The autologous transplantation of CD 34+ cells expanded ex vivo in serum-free conditions dramatically reduces post-myeloablative neutropenia in myeloma patients. In our cell therapy unit, cells for this clinical assay have been expanded under GMP with serum-free Irvine Scientific (IS) medium with stem cell factor (SCF), granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF), and megakaryocyte growth and development factor (MGDF; 100 ng/mL, respectively). Because this clinical-grade IS medium is no longer available, a new serum-free medium, Maco Biotech HP 01 (Macopharma), was evaluated. STUDY DESIGN AND METHODS: Purified CD 34+ cells (Isolex 300i, Baxter) from mobilized peripheral blood samples of myeloma patients were thawed, washed, and cultured, as for previous clinical assays. Twenty million CD 34+ cells were resuspended per 1 L of SCF-, G-CSF-, and MGDF-supplemented medium (HP 01 or IS), introduced into 3-L culture bags (AFC), and cultured for 10 days in 5 percent CO(2), at 37 degrees C, and at 100 percent humidity. RESULTS: A higher amplification of total nucleated cells (NCs) and colony-forming cells (CFCs) was obtained with HP 01 medium than with IS medium (42+/-16.6-fold vs. 20.5+/-5.9-fold for NCs and 26.7+/-7.4-fold vs. 15.5+/-2.5-fold for CFCs, respectively), whereas an increase in CD 34+ cells (3.5+/- 1.2-fold for HP 01 vs. 2.7+/- 1.5-fold for IS) was not significant. IS medium partially maintained SCID-repopulating cells (SRC), whereas the culture in HP 01 medium fully maintained the stem cell activity for 10 days. A higher frequency of CD 41+ cells after expansion in HP 01 than in IS medium was also observed. CONCLUSION: Maco Biotech HP 01 medium is suitable for clinical-scale expansion of CD 34+ cells with the SCF, G-CSF, and MGDF cytokine cocktail, permitting an intensive amplification of CFCs and maintenance of SRCs.     

神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化

背景：体外分离培养出神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的：采用神经球方法分离培养胎鼠皮质神经干细胞,并观察其生长和分化特性。方法：利用无血清悬浮方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,用免疫细胞化学的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果与结论：体外无血清含生长因子的培养液培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球呈巢蛋白表达阳性,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,但主要向神经胶质细胞分化。说明在血清含有生长因子的而培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞。     

神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化

背景:体外分离培养出神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移植研究的前提。目的:采用神经球方法分离培养胎鼠皮质神经干细胞,并观察其生长和分化特性。方法:利用无血清悬浮方法分离培养胚胎来源的神经干细胞,用免疫细胞化学的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果与结论:体外无血清含生长因子的培养液培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球呈巢蛋白表达阳性,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,但主要向神经胶质细胞分化。说明在血清含有生长因子的而培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞。     

海马神经元条件培养液体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞的分化:与含b-FGF培养基和无血清培养基的比较(英文)

背景:目前关于骨髓间质干细胞能否向神经元方向分化的报道不多,且争论多集中在分化后的神经元是否仅具有神经元形态而不具有神经元功能.目的:探讨海马神经元条件培养液诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元样细胞和神经胶质样细胞分化的可能性.方法:将第5代大鼠骨髓间质干细胞分为4组:条件培养基组加入海马神经元和胶质细胞的培养液;b-FGF组加入含b-FGF的DMEM培养基;无血清培养组加入含Neurobasal和B27的无血清培养基;阴性对照组加入含胎牛血清的DMEM.各组诱导12,24 h后,应用免疫细胞化学染色行神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白的鉴定,Western-blot法检测细胞神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白的表达.结果与结论:诱导12,24 h后,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组骨髓间质充干细胞微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达,阴性对照组未见表达.与阴性对照组比较,诱导后24 h,条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组微管相关蛋白2表达均明显增强(P < 0.05),且条件培养基组增强幅度显著高于另两组(P < 0.05);条件培养基组、b-FGF组、无血清培养组神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白表达无明显差异.结果证实海马神经元条件培养液可体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,与含b-FGF的培养基和无血清培养基相比,海马神经元条件培养基诱导的神经元和神经胶质细胞阳性率最高.     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景:传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制. 目的:拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞.方法:抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及鸶茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力.取传至4～6代的大鼠骨髓间充质千细胞.加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定. 结果与结论:P5骨髓间充质千细胞(91.5±3.1)%处于G1期.高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节.骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达.表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞:在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力.