体外诱导胰腺干细胞向胰岛样细胞团的分化

背景：目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。目的：于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛及鉴定的技术和方法。方法：体外获得纯化的小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂对其进行成胰岛方向的诱导分化,并对诱导形成的胰岛样细胞团进行形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR和Western blot检测。结果与结论：实验通过细胞形态学和细胞生长特性的观察以及免疫细胞化学染色证实体外成功获得了小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂将其诱导成胰岛样结构,呈球形,以较细长的蒂部与瓶底连接,双硫腙染色将其染成铁红色。RT-PCR和Western blot法可分别检测到胰岛样细胞团的胰岛素mRNA和胰岛素蛋白。结果证实小鼠胰腺干细胞可体外诱导分化成含β细胞的胰岛样细胞团。     

胎鼠胰腺干细胞体内移植向胰岛样细胞团的分化

背景:由于干细胞的转分化受细胞外基质和基因程序的调控,因此在体外很难模拟体内干细胞巢的微环境而使干细胞定向分化,或许干细胞原位移植是可行方法之一.目的:探讨胎鼠胰腺干细胞在糖尿病鼠体内不同部位移植后分化为胰岛细胞团的可能性.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-03/2007-04在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:16 d龄SD胎鼠12只,10周龄200-250 g的SD雌鼠50只,均由广东省实验动物中心提供.方法:分离纯化胎鼠胰腺干细胞.经荧光原位杂交检测为雄性的第5代胎鼠胰腺干细胞用于体内移植.50只SD雌鼠取10只作为正常对照组,余40只通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,造模后分为4组:胰腺实质内移植组在胰腺实质内多点注射1×106个雄性胎鼠胰腺干细胞,肝内移植组行门静脉穿刺注射等量细胞悬液,肾包膜下移植组于左肾包膜下注射等量细胞悬液,模型对照组胰腺实质内多点注射相同体积的PBS液,10只,组,培养8周.主要观察指标:定期监测大鼠血糖及血浆胰岛素水平,观察胰腺、肝脏及肾脏组织病理学变化.结果:雄性胎鼠胰腺干细胞培养传3代后,巢蛋白阳性细胞率为74.1%.胰腺实质内移植组在移植后第3周血糖开始下降,血浆胰岛素水平逐渐升高;第5周血糖降至正常水平并维持,血浆胰岛素达到正常水平,病理学观察在胰腺内可见外源性胰岛样细胞团,胰岛素免疫组化染色呈阳性,巢蛋白免疫组化染色呈强阳性,荧光原位杂交检测Y染色体呈阳性.肝内移植组、肾包膜下移植组大鼠仍维持高血糖状态,相应组织内均未见外源性细胞团形成.结论:分离纯化的胎鼠胰腺干细胞存胰腺内原位移植后,于体内可转分化为胰岛样细胞团,并使血糖降至正常水平.     

体外诱导脐血间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:目前,国内外对骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞向胰岛β样细胞分化的研究报道较多,但关于脐血间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究报道较少.目的:验证脐血间充质干细胞能否在体外向胰岛β样细胞分化,并探索其诱导条件.方法:在无菌条件下采集正常产妇脐血,用羟乙基淀粉沉淀法分离脐血中的有核细胞,进而采用贴壁筛选法获得脐血间充质干细胞.纯化后的脐血间充质干细胞用表皮生长因子、β-巯基乙醇、高糖、激活素A和肝细胞生长因子进行诱导.观察诱导后的细胞形态变化,采用胰岛素免疫荧光染色对诱导后的细胞进行鉴定,定量检测胰岛素分泌水平及其对葡萄糖刺激的反应性.结果与结论:经过诱导后,细胞形态发生明显变化,形态变圆而且聚集成团;诱导后细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性;而且细胞能分泌少量胰岛素,并对糖刺激具有反应性.在体外,脐血间充质干细胞具有向胰岛β样细胞分化的潜能.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用.关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道.目的:进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性.方法:采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养:传2代后,用高浓度葡萄糖(2s mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化.倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素.结果与结论:第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团:并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团:免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性.结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能.     

诱导人孤雌胚胎干细胞分化为胰岛样细胞团

背景:随着人类孤雌胚胎干细胞系的成功建立,对该细胞的进一步分化功能研究成为新的研究热点.目的:研究体外培养的人类孤雌胚胎干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的潜能.方法:自主建系孤雌来源人胚胎干细胞和正常来源人胚胎干细胞各1株,运用基于胰腺体内发育规律的改良5阶段诱导法诱导人孤雌胚胎干细胞为胰岛样细胞团,加入不同生长因子及诱导试剂对人胚胎干细胞分5阶段序贯培养.结果与结论:终末分化细胞光镜下呈团状聚集,RT-PCR、免疫荧光染色检测分化细胞表达胰岛细胞特征性的基因与蛋白.胰岛素释放实验提示获得的细胞具有胰岛样生化功能.由人类孤雌胚胎干细胞来源的胰岛样细胞团具备胰岛的基本特征,是未来治疗1型糖尿病的可用材料.     

体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化

背景：体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案。目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性。方法：将胎儿骨髓间充质干细胞与胎儿胰岛素细胞分别接种于Transwell双层细胞培养板上下层共培养。对照组中的骨髓间充质干细胞仅用胰岛细胞培养基培养。倒置相差显微镜观察胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰岛细胞的形态,放射免疫分析法检测共培养刺激下胰岛素的分泌情况。结果与结论：未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的骨髓间充质干细胞逐渐变圆,并聚集成团,共培养9d后骨髓间充质干细胞经RAI检测分泌大量胰岛素,DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性。而对照组无胰岛素释放。提示在适当的培养条件下,胎儿骨髓间充质干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。     

体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化

背景:体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案.目的:探讨胎儿骨髓间充质干细胞在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性.方法:将胎儿骨髓间充质干细胞与胎儿胰岛素细胞分别接种于Transwell 双层细胞培养板上下层共培养.对照组中的骨髓间充质干细胞仅用胰岛细胞培养基培养.倒置相差显微镜观察胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰岛细胞的形态,放射免疫分析法检测共培养刺激下胰岛素的分泌情况.结果与结论:未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的骨髓间充质干细胞逐渐变圆,并聚集成团,共培养9 d后骨髓间充质干细胞经RAI检测分泌大量胰岛素,DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性.而对照组无胰岛素释放.提示在适当的培养条件下,胎儿骨髓间充质干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的能力.     

人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果

目的:观察人胎儿胰腺干细体外诱导分化为胰岛样细胞团及治疗大鼠糖尿病的效果。方法:实验于2005-09/2006-09在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。人胰腺干细胞为本实验室冻存的1株传至50代的人胎儿胰腺干细胞。采用DMEM/F12培养液,添加B27、1g/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1g/L牛血清白蛋白、10mmol/L烟酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子及10μg/L肝细胞生长因子,诱导胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团,应用双硫腙染色、RT-PCR及葡萄糖刺激试验对该胰岛样细胞团进行鉴定。采用完全随机法将30只SD大鼠分为链脲菌素注射组24只,正常对照组6只。空腹12h后,两组大鼠分别腹腔注射70mg/kg体质量的链脲菌素和0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠分别于注射前、注射后48h、第5天和第8天空腹断尾采血,测定全血血糖浓度。选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法从已成模的糖尿病大鼠中挑出18只分为3组:胰岛移植组9只,进行肾被膜下胰岛样细胞团移植,每只大鼠植入胰岛数(3000±100)个;干细胞移植组3只,肾被膜下移植未进行诱导的胰腺干细胞,细胞数约2×106个;糖尿病对照组6只,肾被膜下移植不含细胞的培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度,每周定点测空腹血糖及称体质量1次。结果:18只符合糖尿病模型标准的大鼠与正常对照组6只大鼠均进入结果分析。①成功将人胎儿胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,RT-PCR检测表达胰岛素,经葡萄糖刺激能释放胰岛素。②共有22只大鼠糖尿病成模,成模率达91.7%。③胰岛移植组大鼠移植后2周内,血糖浓度均有所降低,但仍高于正常血糖浓度范围;移植后第3周血糖浓度迅速上升,之后一直维持高血糖状态。干细胞移植组大鼠移植后血糖一直处于较高水平,移植后第6周血糖开始下降,之后维持于较低水平。糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。结论:人胎儿胰腺干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞团,该胰岛团能分泌胰岛素,具有一定的抗大鼠糖尿病作用。     

兔脂肪干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞的可行性

背景:胚胎干细胞、胰腺干细胞、肝卵圆细胞、小肠上皮干细胞和骨髓间充质干细胞均可以在体外诱导分化为胰岛β样细胞,那么脂肪干细胞是否也可以呢?目的:探讨兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。方法:以常规方法从兔脂肪抽吸物中分离、培养脂肪干细胞;传2代后,用高浓度葡萄糖(25mmol/L)培养液DMEM以及碱性成纤维生长因子和尼克酰胺诱导兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化。结果与结论:第2代兔脂肪干细胞经过高糖诱导后,细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。说明兔脂肪干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景:相对于其他来源的干细胞而言,脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小,但并不等同于无任何免疫排斥反应.目的:观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化,及其移植后对槠尿病大鼠的治疗效果.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验窀完成.材料:清洁级雄性SD大鼠36只,随机分为4组:胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只.人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供.方法:取传至第3代的人脐带间充质干细胞,待细胞融合至70%～80%后,换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基,向胰岛样细胞诱导分化.除正常对照组外,其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建屯糖尿病模型.造模后,胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2× 106个,间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞,模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL.主要观察指标:诱导后胰岛样细胞的鉴定,胰岛样细胞的移植效果.结果:诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长;诱导4 d后细胞向中央聚集,出现胰岛样细胞团,此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多;诱导7d双硫腙染色呈阳性表达.移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低,一直维持至第6周;间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降,但4周后皿糖浓度上升;模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内.免疫组化染色结果显示,移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达,间充质干细胞组仪有表达少量胰岛素,正常对照组胰岛素表达无明显变化.结论:人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞.与脐带间充质干细胞相比,胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平,且植入后可迅速发挥降糖作用.     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞

背景：人脐带间充质干细胞具有获取容易、免疫原性低等优点,目前尚缺乏体外诱导其分化为胰岛样细胞的成熟方案。目的：探讨人脐带间充质干细胞在体外一定条件下分化为胰岛样细胞的可能性。方法：无菌条件下分离培养人脐带间充质干细胞,细胞传3代后,采用两步法诱导其向胰岛样细胞分化：第1步,加入含100pg／L13-神经生长因子,4nmol／LActivinA,10mmol/L尼克酰胺,25pg／L表皮生长因子,体积分数为10％胎牛血清的DMEM／F12培养基中培养7d;第2步,将诱导液换为含10mmoI／L尼克酰胺,10pg／L碱性成纤维细胞生长因子,1％胰岛素一转铁蛋白一硒的DMEM／F12培养基,诱导时间为14d。对照组单纯加入DMEM／F12培养基进行培养。结果与结论：诱导2周后脐带间充质干细胞开始聚集成团,诱导3周后,葡萄糖刺激试验阳性、PDX-1和Insulin基因表达。而对照组细胞无胰岛素分泌,胰岛细胞相关基因表达阴性。实验成功地将脐带间充质干细胞诱导成了胰岛样细胞。     

小鼠胚胎肝干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

背景:目前肝干细胞尚无特异性标志物,故其分离、培养尤其是纯化技术尚不成熟.目的:观察体外培养的小鼠胚胎肝干细胞生物学特性,及其向肝样细胞的诱导分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在厦门大学附属中山医院消化中心实验室完成.材料:SPF级BALB/c胎鼠20只,13.5 d龄,由厦门大学生命科学学院实验动物中心提供.方法:无菌操作取出胎鼠肝脏,用细胞刮梳理后用Ⅳ型胶原酶消化.取分离纯化后的第2代细胞进行免疫荧光染色.细胞培养到第3代时,分别用3mmol/L丁酸钠盐与0.1%DMSO进行诱导,5 d后收集细胞进行Western blotting实验.主要观察指标:胚胎肝干细胞的形态及表面分子的表达,诱导后胚胎肝干细胞mRNA与蛋白水平的变化.结果:分离培养的细胞第2代即可得以纯化,呈克隆样生长,高表达白蛋白、甲胎蛋白、C-met及角蛋白19,且多数细胞共表达白蛋白与角蛋白19、C-met与角蛋白19,双阳性率约80%.细胞诱导后肝细胞标志物白蛋白表达明显增加,而作为不成熟肝细胞的经典标志物甲胎蛋白表达减少,同时干细胞标志物c-kit mRNA水平也明显下降,角蛋白19水平无明显变化.结论:胚胎肝干细胞具有双向分化潜能,经丁酸钠盐与DMSO诱导后可以向肝样细胞分化.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展

学术背景：近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得一些疗效，但仍存在供体匮乏和免疫排斥两大难题。骨髓间充质干细胞在体外可诱导成为胰岛样细胞。 目的：分析总结骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化研究进展。检索策略：由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1997—08／2007-08的相关文献，检索词“mesenchymal stem cells，insulin secreting cell”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-08／2007-08的相关文献，检索词“骨髓间充质干细胞，胰岛素分泌细胞”，并限定文章语言种类为中文。共检索到108篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①文章所述内容应与骨髓间充质细胞体外诱导分化为胰岛样细胞密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：①重复性研究。②Meta分析。 文献评价：文献的来源主要是通过对骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中，2篇为综述，其余均为临床或基础实验研究。 资料综合：①由于胰腺和神经系统具有相似的发育控制机制，目前认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号。利用人骨髓间充质干细胞多向分化能力，用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长凶子将其诱导成为nestin阳性细胞，该细胞在添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液中为适宜微环境，将被进一步诱导为胰腺样细胞。②目前针对胰岛素样细胞的鉴定与功能学研究有以下几方面：细胞形态学观察是否有类似胰岛样细胞团的聚集;免疫组织化学检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的表达;用RT—PCR法对诱导后细胞的胰岛素及胰高血糖素基因表达测定;葡萄糖刺激的胰岛索释放试验来研究诱导后?     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展

学术背景:近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得一些疗效,但仍存在供体匮乏和免疫排斥两大难题.骨髓间充质干细胞在体外可诱导成为胰岛样细胞.目的:分析总结骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化研究进展. 检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1997-08/2007-08的相关文献,检索词"mesenchymal stem cells,insulin secreting cell",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-08/2007-08的相关文献,检索词"骨髓间充质干细胞, 胰岛素分泌细胞",并限定文章语言种类为中文.共检索到108篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与骨髓间充质细胞体外诱导分化为胰岛样细胞密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,2篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①由于胰腺和神经系统具有相似的发育控制机制,目前认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号.利用人骨髓间充质干细胞多向分化能力,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子将其诱导成为nestin阳性细胞,该细胞在添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液中为适宜微环境,将被进一步诱导为胰腺样细胞.②目前针对胰岛素样细胞的鉴定与功能学研究有以下几方面:细胞形态学观察是否有类似胰岛样细胞团的聚集;免疫组织化学检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的表达;用RT-PCR法对诱导后细胞的胰岛素及胰高血糖素基因表达测定;葡萄糖刺激的胰岛素释放试验来研究诱导后胰腺细胞的功能.结论:随着骨髓间充质干细胞在体外可诱导成胰岛样细胞技术的不断发展,为解决糖尿病细胞治疗所面临的问题提供一个新的方案.经过诱导分化所得到的胰岛样细胞,其胰岛素分泌量远小于正常胰岛细胞,因此目前急需解决在体外高效诱导且符合人生理的胰岛细胞,并将其安全移植入人体等问题.     

体外诱导胚胎干细胞向甲状腺细胞的分化

背景：胚胎干细胞来源于发育早期囊胚的内细胞团，适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增碹能力，且具有多向分化潜能，能够发育分化成机体3个胚层的所有类型细胞。目的：观察体外定向诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测。设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2004-01／2006—12在中山大学附属第二医院脐血库完成。材料：孕12．5～14．5d的Balb／c孕鼠用于胚成纤维细胞饲养层的制备。E14小鼠胚胎干细胞细胞株由美国哈佛大学Dr．Xu教授惠赠。成年昆明种小鼠用于甲状腺细胞的提取。方法：将制备的鼠胚成纤维饲养层接种于E14小鼠胚胎干细胞进行扩增培养。将脱离饲养层细胞后呈稳定克隆生长的胚胎干细胞诱导发育为胚胎体，再逐步添加促甲状腺素、胰岛素、碘化钾等共培养。以培养的成年昆明种小鼠甲状腺细胞为阳性对照。主要观察指标：①观察分化过程中细胞形态的变化。②免疫荧光法检测分化细胞标记物TSHR，PAX8，TTF-2，TTF-1的表达。③RT-PCR法检测分化细胞相关基因TSHR、PAX8，NIS，TPO，Tg的表达。结果：分化细胞边界清晰，呈圆形、类圆形、梭形或多角形贴壁生长。诱导培养第6天分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8，NIS，TPO，Tg，TSHR的表达，第8天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR，TTF-1，PAX8，TTF-2的表达，阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论：胚眙干细胞经胚胎体发育阶段，在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞实验研究

目的 探索人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)在胰岛细胞微环境中向胰岛样细胞的分化潜能及功能变化趋势.方法 将分离的第3代hUC-MSCs用低糖达尔伯克必需基本培养基(L-DMEM)重悬,接种单纯培养组及与大鼠胰岛细胞共培养组(共培养组).倒置显微镜观察hUC-MSCs的形态变化;流式细胞仪鉴定其细胞表面标志;免疫细胞化学鉴定胰十二指肠同源框-1基因(PDX-1)的表达;放免法检测hUC-MSCs胰岛素和C肽的分泌及对糖刺激的反应.结果 hUC-MSCs呈均一纺锤形平行排列或漩涡状排列生长,不表达CD34、CD45和CD14,高表达CD29、CD44和CD105;共培养组诱导后3 d及7 d经细胞逐渐变圆并聚集成团,PDX-1呈阳性表达,至10 d及14 d PDX-1阳性细胞罕见.单纯培养组细胞形态未发生变化,PDX-1表达阴性.共培养组培养上清中检测到较高水平的胰岛素及C肽,单纯培养组检测到少量的胰岛素,检测不到C肽,两组培养3、7、10和14 d的胰岛素分泌水平比较差异均有统计学意义(P<0.01).共培养组胰岛素及C肽水平以7 d最高,10 d次之,与3 d和14 d比较差异均有统计学意义(P<0.01),共培养组糖刺激指数为1.41.结论 hUC-MSCs在胰岛细胞微环境中具有向胰岛样细胞分化的潜能,其内分泌功能随体外诱导时间的延长呈现先递增后递减的趋势.     

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。目的:探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。方法:取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代,流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导:①M0组:不添加任何因子。②M1组:20μg/L肝细胞生长因子。③M2组:20μg/L肝细胞生长因子+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组:20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组:20μg/L肝细胞生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色,在诱导第14天时表达降低,21d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P<0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用,二者有协同作用。     

体外三维支架诱导脂肪干细胞向髓核样细胞的分化

背景:髓核组织工程被认为是椎间盘退变修复的理想方法,种子细胞是髓核组织工程的关键因素,但髓核细胞来源有限.目的:探讨兔脂肪干细胞在体外三维支架诱导培养条件下能否向髓核样细胞分化.设计、时间及地点:细胞.支架学体外观察,于2008-07/12在解放军北京军区总医院全军骨科研究所完成.材料:清洁级3月龄日本大耳兔3只,由北京实验动物技术有限公司提供.医用级壳聚糖为浙江金壳生物化学公司产品.方法:无菌条件下切取兔皮下脂肪组织,胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞.取传至第2代细胞制成细胞悬液50 μL(5×10~6个细胞),与150 μL壳聚糖-藻酸盐复合物混合,置入12孔板,室温下20 min左右形成凝胶状.设立3组,对照组仅添加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养液2 mL;低氧诱导组、正常氧气诱导组均加入含牛血清白蛋白、转化生长因子β1、地塞米松、维生素C、BMP-7、1%ITS-plus、体积分数为10%胎牛血清的DMEM液,然后分别通气体积分数为2%的O_2和20%的O_2.各组置入37℃、体积分数为5%的CO_2饱和湿度培养箱中培养21d.主要观察指标:组织形态学观察,蛋白多糖水平,Ⅱ型胶原水平.结果:扫描电镜显示细胞在支架内正常黏附,细胞绒毛清晰可见,生长状态良好,番红O染色与阿利辛蓝染色均呈阳性,产生较多的蛋白多糖.随时间延长,对照组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均无明显变化;低氧诱导组、正常氧气诱导组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均显著增加,与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.001,P＜0.05);且低氧诱导组产生蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均多于正常氧气诱导组(P＜0.05,P＜0.01).结论:在适当的诱导条件下,兔脂肪干细胞在壳聚糖-藻酸盐凝胶支架中可以向髓核样细胞分化,产生与髓核组织相同的细胞外基质,且低氧状态下诱导效果较好.