构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR-1）基因的siRNA前体表达载体．鉴定其对U937细胞株VEGFR—j基因干扰效率。方法体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰载体．通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人单核白血病细胞株U937．应用Real—TimePCR、Western印迹法检测抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同。Real—TimePCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1mRNA表达率下降75．98％,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR—1基因的表达。     

大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定

目的 应用特异性siRNA抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kit3.1基因表达;筛选出干扰效率最高的siRNA,并应用分子生物学方法进行鉴定.方法 设计并化学合成3条针对Kir3.1基因的siRNA,脂质体法转染原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞.应用Real-time PCR筛选出抑制效率最高的siRNA,将其转染入细胞;于转染后24 h、48 h、72 h提取细胞总RNA及蛋白质,分别采用Real-time PCR和Westem blot检测Kir3.1 mRNA及蛋白质表达情况.,结果 Real-time PCR显示siRNA-3干扰效率强于siRNA-1,2,能够显著下调心房肌细胞Kir3.1 mRNA的表达;siRNA-3转染心房肌细胞后,发现其在24,48,72 h均能使Kir3.1 mRNA及蛋白表达下降.结论 针对Kir3.1 mRNA合成的siRNA能够特异性干扰Kir3.1基因表达和蛋白质的合成,这可能为心律失常性疾病的治疗提供新的实验性依据.     

慢病毒介导RNA干扰Clusterin基因表达载体的构建及其在肾癌786-O与ACHN细胞系中的表达

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度＞4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.     

HSP90β在ATRA诱导的白血病细胞株HL60耐药中的作用研究

目的:通过检测HSP90β基因在白血病细胞株HL60及其耐药株HL60/ATRA中的表达差异,探讨HSP90β基因在ATRA相关多药耐药性发生中的作用.方法:采用ATRA浓度递增及间歇诱导法建立HL60/ATRA耐药细胞株;用MTT法和流式细胞检测技术(Flow cytometry,FCM),分别检测HL60和HL60/ATRA细胞的增殖及细胞周期;RT-PCR、Western blot法检测HSP90 β基因在HL60及HL60/ATRA细胞中的表达;通过MTT法检测HL60和HL60/ATRA细胞对常用化疗药物(VCR、CTX、VP-16、ADM)敏感性.结果:成功构建了白血病细胞耐药株HL60/ATRA;在mRNA和蛋白两个水平,均检测到HSP90β在耐药株HL60/ATRA中的表达较HL60明显增高(P＜0.01);药敏结果显示HL60/ATRA细胞对VCR、CTX、ADM、VP-16的耐药倍数分别为10.74、5.51、4.01、3.24.结论:ATRA能够诱导HL60细胞中HSP90 β高表达,经ATRA诱导后的HL60/ATRA细胞对抗癌药物的敏感性显著降低、耐药性增高,这提示HSP90 β可能在ATRA相关多药耐药性的发生过程中发挥着重要作用.     

siRNA靶向抑制CPB2基因对乳腺癌细胞TAFI表达及生长和转移的影响

目的探讨靶向羧肽酶B2(CPB2)基因的小干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)表达以及对乳腺癌细胞的生长和转移的影响。方法将细胞分为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、阴性对照组和空白对照组5组,设计并化学合成编码TAFI基因(CPB2)的特异性siRNA,用脂质体2000转染至MDA-MB-231细胞中,采用Western blot、RT-PCR分别检测各组TAFI蛋白及mRNA的表达,Transwell侵袭实验检测癌细胞转移侵袭能力,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活和生长情况。结果 siRNA抑制CPB2表达后,TAFI蛋白及其mRNA表达水平显著下降,siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组与阴性对照组比较细胞侵袭力和细胞生长都明显受到抑制(P<0.05)。结论靶向CPB2的siRNA可有效下调乳腺癌细胞MDA-MB-231中TAFI蛋白及其mRNA表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭力,抑制细胞的生长和转移。     

RNA干扰沉默MKK7对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰沉默丝裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MKK7)基因对SH-SY5Y细胞凋亡的影响?方法:设计并合成针对MKK7的小干扰RNA (small interference RNA,siRNA)3条(MKK7siRNA-1?MKK7siRNA-2?MKK7siRNA-3)及与MKK7基因无同源性的带有红色荧光的阴性对照siRNA(negative control siRNA),在lipofectamine 2000介导下转染SH-SY5Y细胞,荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR观察MKK7 mRNA表达及Western blot 检测MKK7蛋白的表达,进而筛选出转染效果好的MKK7siRNA,CCK-8检测各组细胞活力,Hochest 33258检测各组细胞凋亡染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测p-JNK?凋亡蛋白cleaved caspase-3的变化?结果:① MKK7siRNA-3组的MKK7 mRNA表达最低,MKK7蛋白表达最低;②与空白对照组(control group)比较,MKK7siRNA-3组的细胞活力无统计学差异,p-JNK?cleaved caspase-3水平降低,凋亡率降低?结论:RNA干扰沉默MKK7可通过下调JNK磷酸化进而抑制SH-SY5Y细胞的凋亡?     

siRNA对VEGFR2的表达抑制及对HL60细胞和人内皮细胞的影响

 【目的】为探索治疗白血病的新思路研究了小干扰RNA（siRNA）对肿瘤细胞株HL60和人血管内皮细胞（EC）株EA·hy926血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因表达的抑制作用。【方法】制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA，并据此设计shRNA寡核苷酸链，构建pENTR^TM／U6干扰表达载体。瞬时转染细胞．采用MTF法、RT-PCR法及Western blot测定VEGFR2表达抑制情况。【结果】VEGFR2 siRNAa、b、c抑制HL60细胞效率分别为77．5％、45．0％、80．9％，以siRNAc最高，利用其shRNA和pENTR^TM／U6构建的入门克隆转染HL60，抑制细胞效率达99．1％；此入门克隆对VEGF＆基因mRNA和蛋白的表达抑制在HL60和EA·hy926细胞均显著。【结论】在体外shRNA表达载体可有效抑制HL60细胞VEGFR2自分泌和旁分泌，有效抑制白血病细胞生长。     

HIF-1α靶向RNAi慢病毒载体的构建及对Panc-1细胞HIF-1α抑制作用的研究

目的：构建针对缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,并研究其对胰腺癌Panc-1细胞HIF-1α基因表达的抑制作用。方法：针对HIF-1α基因序列设计合成4条shRNA片断并构建RNAi慢病毒载体,同时构建HIF-1α基因过表达质粒。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot进行外源筛靶。将外源筛靶成功的干扰质粒psc1516进行慢病毒包装,再感染Panc-1细胞,Western blot和荧光定量PCR检测沉默前后Panc-1细胞中HIF-1α的蛋白及mRNA的表达。结果：经PCR及测序证实4种干扰载体及1种过表达载体构建成功,Western blot外源筛靶显示4个靶点均能有效敲减目的基因的表达。细胞试验表明psc1516干扰载体能有效抑制Panc-1细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白的表达,当MOI=4时,对HIF-1αmRNA的抑制率为87.4%,蛋白抑制率达90.0%以上。结论：RNAi慢病毒载体可有效地抑制胰腺癌Panc-1细胞中HIF-1α的表达。     

RNA干扰抑制c-myc基因对体外培养大鼠血管平滑肌细胞活性的影响

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖是导致移植静脉再狭窄的主要原因之一,早期应答基因c-myc是促进平滑肌细胞持续增殖的关键基因。探讨针对c-myc基因的RNA干扰对体外培养平滑肌细胞增殖和活性的影响。方法体外培养大鼠VSMCs,构建3对针对c-myc基因的RNA干扰序列(siRNA-1#、siRNA-2#、siRNA-3#)和1组阴性对照序列,以Lipo2000为载体转染体外培养细胞,Q-RT-PCR检测c-myc mRNA表达,Western blot检测转染c-myc蛋白表达,MTT法检测细胞增殖状态和活性。结果转染3对siRNA序列48h后,各组c-myc mRNA表达水平显著低于阴性对照组和正常细胞组,3组转染组之间c-myc mRNA表达无显著差异。转染siRNA-1#、siRNA-2#序列后,c-myc蛋白表达低于转染siRNA-3#序列组、阴性对照组和正常细胞组,而转染siRNA-3#序列组c-myc蛋白表达与阴性对照组和正常细胞组相比无明显差异。转染24 h各组间细胞活性未见显著差异,48h时细胞活性与24h相比无显著增加,至72h时各组细胞活性有明显增加,以转染siRNA-1#序列组增加量最少。阴性对照组和正常细胞组抑制效率基本保持为零水平。转染siRNA-1#、siRNA-2#序列后,24、48、72 h后抑制效率逐渐增加,转染siRNA-3#序列后72h后其抑制效率开始降低,各相同时间点以转染siRNA-1#序列后抑制效率最高。结论体外转染c-myc基因siRNA序列,能显著降低平滑肌细胞c-myc基因mRNA和蛋白表达,抑制细胞活性和增殖。随着作用时间延长,RNA干扰(RNA interference,RNAi)后细胞活性缓慢增加,而抑制效应持续显著增加,以siRNA-1#序列抑制作用最为明显。     

RNA干扰技术对HeLa细胞hTERT基因的抑制作用

目的 探讨RNA干扰对宫颈癌HeLa细胞人端粒酶反转录酶基因的抑制效应。方法 化学合成靶向于hTERT基因的siRNA,用阳离子脂质体转染法将其导入宫颈癌细胞内。实验分组:转染组siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、阴性对照组(siRNA-NC)、空白对照组(Blank)。通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 siRNA-3组的端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平显著下降,hTERT蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显升高,与其他各组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 运用RNAi干扰技术,以hTERT基因为靶点的siRNA能特异性抑制宫颈癌HeLa细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制宫颈癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据。     

慢病毒载体介导RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231细胞LOX基因表达的影响

目的:观察慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV)转染对乳腺癌高侵袭转移潜能MDA-MB-231细胞LOX基因表达的影响.方法:设计合成特异性的LOX RNA干扰慢病毒载体,稳定转染至MDA-MB- 231细胞中,实时定量PCR、Western blot检测LOX mRNA和蛋白的表达情况.结果:稳定转染慢病毒RNAi...     

Role of Extracelluar Regulated Protein Kinases in FTY720-induced Apoptosis of Leukemia Cell Lines HL-60 and U937

The effects of a novel immunosuppressive agent FTY720 on proliferation inhibition and apoptosis of acute leukemia cell lines HL-60 and U937, and the role of extracelluar regulated protein kinase (ERK) in the course of proliferation inhibition and apoptosis induced by FTY720 were studied. The proliferation inhibition rate of HL-60 and U937 cells by various concentrations of FTY720 was detected by MTT assay. Cell apoptosis was detected by DNA fragmem analysis and flow cytometry. The phosphorylated ERK1/2 protein expression was observed by Western blotting. The change of intracellular distribution of ERK1/2 protein was identified by SP immunohistochemical staining. The results showed that FTY720 could inhibit the growth of HL-60 and U937cells effectively in a dose-dependent manner. After incubation with FTY720 for 24 h, apoptosis wasobserved in HL-60 and U937 cells. The intracellular expression of phosphorylated ERK1/2 protein was also down-regulated and the distribution of ERK1/2 protein in cell‘ nuclear was reduced during FTY720-induced apoptosis. So, that FTY720 inhibited ERK1/2 phosphorylation might mediate the role of FTY720-induced apoptosis and proliferation inhibition of leukemia cells.     

TNF-α对人lrg基因表达的调控

目的：观察TNF-α对脂多糖应答基因（lrg）在人HEK293和U937细胞中表达的影响．方法：正常培养人胚肾细胞（HEK293）和人单核细胞（U937）,用TNF—α（终浓度1×10^6U／L）刺激2h．提取刺激前后HEK293和U937细胞的总蛋白,用纯化后的兔抗人Lrg抗血清作一抗（1：1000）,对TNF—α刺激前后的HEK293和U937细胞进行Western Blot分析．提取刺激前后HEK293和U937细胞的总RNA,用RT—PCR分析TNF-α对lrg在细胞中表达的影响．以B-actin为内参．结果：Western Blot分析显示,用TNF-α刺激2h后,妇在人HEK293和U937细胞内的蛋白含量明显上升;RT—PCR结果显示,用TNF-α刺激2h后,人HEK293和U937细胞内的垤mRNA水平明显上升．结论：TNF-α的刺激增强了人HEK293和U937细胞内lrg的表达,提示lrg可能参与了TNF—α诱导的炎症反应．     

SiRNA靶向沉默成纤维细胞激活蛋白仅对胶质瘤细胞U87增殖的影响

目的：探讨小分子干扰RNA（siRNA）靶向沉默成纤维细胞激活蛋白仅（FAP-α）表达对神经胶质瘤细胞株U87增殖的影响。方法：实验分为空白对照组（Blank组）、阴性对照组（NC组）和siRNA组,通过脂质体将siRNA转染至胶质瘤细胞株U87,使用Westernblot法检测FAP-α基因的蛋白水平,同时检测NC组和siRNA组Bcl-2、caspase-3的表达变化,使用Real-timePCR法检测FAP-α和增殖核抗原（PCNA）的mRNA水平,CCK-8法评价转染后NC组和siRNA组细胞的增殖能力。结果：①转染48h后,siRNA组细胞FAP-α mRNA、蛋白的表达明显低于NC组和Blank组,差异有统计学意义（P〈0．01）,siRNA组较Nc组caspase-3蛋白表达增加（P〈0．05）;Bcl-2蛋白表达明显降低（P〈0．01）,siRNA组较NC组PCNAmRNA表达明显下降（P〈0．01）。②转染后48、72和96hsiRNA组U87细胞吸光度值低于NC组,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：应用siRNA沉默FAP-α基因的表达,可以抑制胶质瘤细胞U87的增殖,诱导胶质瘤细胞的凋亡。     

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用

目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响。方法 利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VE F mRNA的siRNA．通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照．用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT—PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0／G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。     

姜黄素逆转HL60/ADR 及MCF-7/ADR的多药耐药研究

目的观察姜黄素对HL60/ADR以及MCF-7/ADR多药耐药(MDR)的逆转。方法用MTT法观察细胞的生长抑制效应,流式细胞仪检测凋亡以及细胞内阿霉素浓度,RT-PCR以及Western Blot检测Mdr1、MRP基因和Bcl-2蛋白表达。结果加入姜黄素后耐药细胞系逆转指数分别为4.18(HL60/ADR)和3.39(MCF-7/ADR),与单纯应用阿霉素相比差异有统计学意义;流式细胞仪检测显示有明显的促凋亡作用,耐药细胞系内的ADR浓度明显升高;RT-PCR以及Western Blot检测发现姜黄素对上述耐药细胞系的MRP以及Bcl-2表达有抑制作用。结论姜黄素可能作为多药耐药的逆转剂应用于MDR逆转。     

4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.     

凋亡相关蛋白BCL-2与白血病化疗药物敏感性的研究

目的 :研究急性白血病 (AL)细胞BCL 2表达及其与体外化疗药物敏感性的关系。方法 :采用Westernblotting技术和四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT法 ) ,分别检测HL 60、U93 7细胞株和 6例急性髓性细胞白血病 (AML)细胞BCL 2表达水平及体外对柔红霉素 (DNR)的敏感性。结果 :( 1)BCL 2表达水平HL 60细胞高于U93 7细胞 ,而 6例AML细胞BCL 2表达水平不同 ;( 2 )MTT检测结果显示 ,DNR对HL 60抑制率低于U93 7;BCL 2高表达的AML细胞 ,DNR抑制率低。结论 :细胞系和白血病原代细胞的BCL 2高表达伴低药敏与AML疗效有关。     

白血病细胞株HL60和HL60/DNR的多药耐药性

目的研究白血病细胞的多药耐药性（ＭＤＲ）。方法用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ＨＬ６０，ＨＬ６０／ＤＮＲＭＤＲ１的ｍＲＮＡ表达，用流式细胞仪分析单抗ＵＩＣ２标记的细胞株Ｐ糖蛋白（Ｐｇｐ）的表达，了解它们摄取和滞留荧光素Ｒ１２３的功能。结果ＨＬ６０／ＤＮＲ在ｍＲＮＡ水平高度表达ＭＤＲＩ，在蛋白质水平高度表达Ｐｇｐ，功能性试验中细胞内Ｒ１２３最终浓度ＨＬ６０为ＨＬ６０／ＤＮＲ的５０倍。结论ＨＬ６０／ＤＮＲ为典型的表达ＭＤＲ１的细胞株