荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

目的对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价检测能力及在国境口岸的应用价值。方法应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌,以传统药物敏感性试验为标准,获得该方法的灵敏性、特异性。结果对347例结核病人临床分离培养样本,传统药物敏感性试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本。荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏性为93.42%,特异性为97.42%,符合率为96.54%。结论荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查。     

Gene-Xpert MTB/RiF与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药分析

目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作为金标准进行比较。结果 235例标本中比例法药敏试验利福平耐药12例(5.1%)、Gene-Xpert MTB/RiF利福平耐药例15例(6.4%)、熔解曲线法利福平耐药19例(8.1%),Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法敏感度分别为91.7%和100.0%;特异度分别为98.2%和96.7%。结论Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法两者均可应用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测,Gene-Xpert MTB/RiF法在我国开展结核菌耐多药筛查具更有较强的实用性,有更广的应用前景。     

高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药性研究

目的评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值。方法用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测。以rpoB基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ~2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性。用Kappa检测分析两种结果的一致性。结果药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株。以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36%,特异性为92.59%,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌 对利福平耐药性研究

摘要：目的　评价高分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔ,ＨＲＭ） 技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药 性的临床应用价值。方法　用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的５０株 临床分离菌进行耐药性检测。以狉狆狅犅基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分 析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用ＳＰＳＳ１７．０分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验 结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ ２ 检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异 性。用Ｋａｐｐａ检测分析两种结果的一致性。结果　药敏试验结果显示,５０ 株菌中有１ 株为非结核分枝杆 菌;４９株中有２０株同时对利福平和异烟肼耐药、１株仅对利福平耐药;ＨＲＭ 检测结果显示,２１株对利福 平耐药,２８株为敏感株。以传统药敏试验为参考,ＨＲＭ 检测利福平耐药性的敏感性为８６．３６％,特异性 为９２．５９％,经Ｋａｐｐａ检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论　ＨＲＭ 可快速检测结核分枝杆 菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。 关键词：高分辨率熔解曲线（ＨＲＭ）;结核分枝杆菌;利福平;耐药性;药敏试验;狉狆狅犅基因;分子诊断 中图分类号：Ｒ４４６．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１９）０３ ０１６１ ０４     

PCR熔解曲线法筛查结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药性

目的 利用PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌(MTB)对链霉素、乙胺丁醇耐药性,并与药敏试验结果比较,评价其应用价值.方法 收集深圳市2007-2009年331株MTB临床分离株,应用PCR熔解曲线法检测embB基因306、378～380、406和497、rpsL基因43、88及rrs基因513～517、905 ～ 908位点耐药突变,并与药敏试验结果比较.结果 以药敏试验结果为标准,PCR熔解曲线法检测MTB链霉素耐药突变的敏感性为78.6％、特异性为90.1％、准确性为86.7％;检测MTB乙胺丁醇耐药突变的敏感性为83.0％、特异性为93.3％、准确性为91.8％.PCR熔解曲线法与药敏试验检测结果具有很好的一致性.结论 PCR熔解曲线法能够快速、特异地检测MTB对链霉素、乙胺丁醇耐药突变,可用于临床筛查.     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因的检测

目的 评估应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平（RFP）耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR0－SSCP方法对93株结核分支杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株,耐RFP或含耐RFP耐多药株58株）和33例耐RFP肺结核病人痰标本rPOB基因突变进行检测,并对部分常规药敏试验耐药而用PCR－SSCP未检测到rPOB基因突变的PCR扩增产物阴性菌株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB基因PCR扩增产物258bp片段SSCP图谱正常;58株耐RFP分离株中,52株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为89．7％。SSCP图谱正常的5株耐RFP的PCR产物经测序证实,4株在531位密码子TCG→TTG,1株在526密码子CAC→TAC,1株未改变。33例耐RFP肺结核病人痰酝标本有30例PCR扩增阳性,23例SSCP图谱与H37RV株有差异,rPOB突变率为76．7％。结论 PCR－SSCP 以快速、准确地检测结核分支杆菌rPOB基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测。     

分子信标荧光定量PCR法在结核病临床诊断中的应用

[目的]评价分子信标荧光定量PCR法检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值.[方法]分别采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法和集菌培养法检测272例肺结核临床标本,比较3种方法的检出率,分析有无差异.[结果]分子信标荧光定量PCR法的检出率显著高于抗酸染色法和集菌培养法,阳性率分别为66.91%、10.75%和43.01%.[结论]分予信标荧光定量PCR法检测临床样本中结核分枝杆菌具有快速、敏感和特异性高的特点,可为结核病的临床诊断提供一种快速、准确的病原学诊断手段,具有重要的临床意义.     

荧光PCR探针熔解分析法检测质粒介导ampC耐药基因的应用与评价

目的探讨多重荧光PCR-探针熔解分析法应用于临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ampC耐药基因的检测方法,并评价该方法的临床应用价值。方法收集医院2009年7月-2010年6月的临床分离菌株,首先采用头孢西丁纸片法进行耐药表型筛选,再同时应用传统PCR技术与荧光PCR-探针熔解曲线法对临床分离菌株进行检测,并对ampC耐药基因扩增产物进行DNA测序。结果经头孢西丁纸片法筛选出176株对头孢西丁不敏感临床分离菌株,其中97株为肺炎克雷伯菌、79株为大肠埃希菌;在176株临床分离株中,荧光PCR-探针熔解分析法检测出36株ampC耐药基因阳性菌株,包括18株DHA型、12株CIT型和5株EBC型,还有1株肺炎克雷伯菌同时含有DHA型和EBC型;而传统PCR技术检出32株ampC耐药基因阳性,两个检测结果的符合率为97.7%;DNA测序后经BLAST比对,荧光PCR-探针熔解分析法检测ampC基因型与所检测目的基因型一致。结论荧光PCR-探针熔解分析法能高效检测出质粒介导ampC耐药基因,其方法简便、敏感性高、特异性强,具有良好的临床应用价值。     

荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌感染的流行特征

目的 应用荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌(NTM)的感染趋势、分布特征、流行状况,为该地区NTM感染的防治提供参考依据。方法 收集2016—2020年间宜昌地区在某院就诊的疑似结核病患者的胸腔积液、腹腔积液、痰、支气管肺泡灌洗液标本,经萋-尼抗酸染色涂片、MGIT 960快速培养和改良罗氏培养检出的所有分枝杆菌阳性标本进一步经荧光PCR熔解曲线法鉴定结核分枝杆菌(MTB)及NTM菌种。以全基因组测序(WGS)为金标准,对比分析荧光PCR熔解曲线法鉴定MTB及NTM的准确性,总结该地区NTM感染患者的临床特征。结果 共收集7 496份分枝杆菌阳性标本,经荧光PCR熔解曲线法鉴定,检出6 997株(93.34%)MTB与499株(6.66%)NTM。NTM菌种鉴定共确定469株(93.99%)NTM菌种,其余30株(6.01%)为未知菌种。检出最多的NTM为胞内分枝杆菌(189,37.88%),其次依次为脓肿分枝杆菌(68株,13.63%)、戈登分枝杆菌(25株,5.01%)。选择荧光PCR熔解曲线法鉴定的22株MTB和18株NTM行WGS,符合率为98.15%,灵敏度为9...     

47株结核分枝杆菌利福平耐药决定区基因突变特征的研究

目的了解吉林省结核分枝杆菌的利福平耐药决定区(RRDR)基因突变特征。方法结核分枝杆菌(MTB)分离自2008-2009年吉林省临床肺结核病人的痰液标本,培养方法为改良酸性罗氏(L-J)培养基。分离出的抗酸杆菌经对硝基苯甲酸(PNB)培养基初步鉴定后选出结核分枝杆菌复合群并应用比例法进行药敏试验(DST)。根据DST结果,选择22株利福平耐药株、22株利福平敏感株以及3株临界值标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增rpoB中包含RRDR在内的部分基因,阳性DNA片段通过基因测序以及Bioedit软件分析方法比对基因突变情况。结果 22株利福平耐药株中,16株同时对异烟肼耐药;22株利福平敏感株中,1株异烟肼耐药。利福平耐药菌株中,95%(21/22)的菌株在利福平耐药决定区RRDR发生了基因突变,其中第531位密码子突变频率占50%,第526位占27%,第533位占9%,第516位及513位均为4.5%;22株利福平敏感株中,RRDR区全部无基因突变发生;3株临界值标本中,1株在第531位密码子发生了基因突变,1株在533位发生基因突变,最后1株无突变。结论 RRDR区点突变的发生与利福平耐药高度一致;异烟肼耐药与利福平耐药高度相关。     

PCR-SSCP银染法检测结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 探讨结核分枝杆菌对链霉素（SM）的耐药分子机制,建立快速、准确的SM耐药性检测方法。方法 应用PCR－SSCP银染分析技术,检测87例结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL基因变异情况,以结核分枝杆菌H37Rv标准株做对照。结果 25株对SM敏感的临床分离株rpsL基因未见异常,62株耐SM的临床分离析中48株rpsL基因SSCP分析结果异常。结论 rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,PCR－SSCP技术可以快速、准确地检测结核分枝杆菌对SM的耐药性。     

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒(探针熔解分析)的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical performance of a probe melting analysis ( PMA)-based real-time PCR detection kit in rapid detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods The specificity of the assay was evaluated by detecting 37 non-tuberculous mycobacteria (NTM) ,and the detection limit of the method was evaluated by genomic DNA of a standard strain H37Rv. Finally, 962 clinical isolates were analyzed with the PMA assay by detecting mutations in rifampin resistance-determining region (RRDR) of rpoB gene, and results were verified with DNA sequencing. Results Among 37 NTM strains,three strains showed drug resistant mutation signals. The PMA method could detect down to 30 bacteria per reaction. Sample analysis showed that 186 of 962 isolates were mutants,751 isolates were wild type and 25 isolates failed to give amplification signals. Among the mutant samples detected, 112 samples from November 2009 to April 2010 were further analyzed by sequencing, as well as 200 wild-type samples. The results showed a complete agreement with the PMA assay except for 5 samples failed in sequence analysis. Conclusion The PMA assay is rapid, accurate and easy-to-use, and thus can be used for detection of rifampin-resistant in clinical isolate samples.     

杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株的MIRU-VNTR基因分型研究

目的：探讨MIRU-VNTR技术在杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株基因分型中的应用。方法收集杭州市2010年4月-2012年6月各结核病定点医院分离培养的临床菌株,进行药物敏感性检测。分别采用RD105缺失基因检测法和MIRU-VNTR技术对氧氟沙星耐药株进行菌株鉴定和基因分型。结果筛选出的52株氧氟沙星耐药株中,43株（82.69%）为北京家族菌株。经12个MIRU-VNTR位点组合分析,52株氧氟沙星耐药株呈52种MIRU-VNTR基因型,总Hunter-Gaston指数（ HGI）为0.999。除MIRU40和ETR-F外,其他10个MIRU-VNTR位点对北京家族菌株和非北京家族菌株均显示较高或中等程度的分辨率。结论筛选到的10个MIRU-VNTR位点具有较高分辨率,适用于杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株分型。     

1699例结核分枝杆菌对利福平和异烟肼药物耐药性分析

目的分析结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药情况,为结核病的防治、管理、制定控制策略提供科学的依据。方法采用WHO推荐的结核病耐药性监测的抗结核药物敏感试验比例法,对1 699例临床分离株进行耐药性测定。结果 1 699例结核分枝杆菌分离株中,耐RFP菌株112例,耐INH 165例,RFP的耐药率为6.6%,INH的耐药率为9.7%。在112例耐RFP中,INH同时耐药者83例,占RFP耐药株总数的74.1%;在165例耐INH中,RFP同时耐药者83例,占INH耐药株总数的50.3%。结论耐多药肺结核的诊断还是遵循同时进行抗结核药物RFP和INH药敏试验稳妥。     

焦磷酸测序技术在利福平rpoB基因突变检测中的应用评价

目的 应用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用价值.方法 利用焦磷酸测序技术,测定150株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因81个碱基的利福平抗药性决定区(RRDR),分析rpoB基因突变特点,并与绝对浓度法和MIC法药敏结果进行比较.结果 150株结核分枝杆菌中66株耐药84株敏感,54株为耐多药菌株,rpoB基因突变涉及6个密码子12种突变基因型,最常见的突变位点及突变形式分别为531位TCG突变为TYG,占60.6%,526位CAC突变为TAC、GAC,占22.7%.耐药性检测结果表明,焦磷酸检测法与绝对浓度法二者的符合率为92.7%,与MIC法的符合率为97.8%.结论 焦磷酸测序检测技术不仅是一种快速、准确、高通量的利福平分子药敏检测方法,同时也是结核分枝杆菌耐药性研究的有用工具.     

应用VNTR技术对绵阳地区结核分枝杆菌进行基因分型

目的应用数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTRs)分析技术探讨绵阳地区结核分枝杆菌的基因分型,为结核病的防治提供科学依据。方法选取绵阳地区结核分枝杆菌临床分离菌株,采用聚合酶链反应(PCR)分别对VNTR位点进行检测分析,应用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果共对79株结核分枝杆菌的15个VNTR位点进行了检测,结果显示明显的基因多态性。各个位点的分辨能力不同,QUB-11b位点的分辨指数(Hunter-Gaston index,HGI)最高,为0.880;ETR C的HGI最低,为0.234;总HGI达到1。经聚类分析,79株菌可分为7个基因群、79个基因型,以Ⅲ群和Ⅴ群所占比例较大,Ⅲ群含37株菌,占46.8%;Ⅴ群含33株菌,占41.8%,其他菌株呈散在分布。结论绵阳地区结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性,主要流行菌群为Ⅲ群和Ⅴ群,应加强此两群菌株的监控。     

结核菌耐药pncA和embB基因突变与临床治疗的研究

目的 分别了解结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pncA和embB基因突变情况，研究其治疗对策。方法 通过传统药敏实验和聚合酶链反应(PCR)一单链构象多态性(SSCP)技术初步鉴定106株临床分离株的药敏和embB、pncA基因。结果 与结核菌标准株H37RV对照分析94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)的pncA基因突变率为44．69％(42／94)，分析83例耐乙胺丁醇(EMB)的embB基因突变率为54．2％(45／83)，两种基因同时突变率为11．8％(11／94)，其中embB基因均在传统药敏的高耐药区域。根据上述分析建立的个体化化疗方案治疗，痰菌转阴率为65．9％(62／94)，病灶治疗有效率为69．1％(65／94)，空洞治疗有效率为56．4％(53／94)。结论 临床部分结核分枝杆菌耐EMB和PZA是由于其embB、pncA基因突变所致，临床根据传统药敏的高、低耐药浓度和基因突变的情况制定的治疗方针，对多耐药结核疗效显著。     

GeneXpertMTB/RIF和Hain技术对痰涂片阴性肺结核诊断价值及利福平耐药性的评估

目的探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpertMTB/RIF)、线性探针(Hain)技术对痰涂片阴性肺结核的诊断价值及利福平耐药性的评估价值。方法选择2018年3月至2019年6月上海市浦东新区肺科医院收治的3次痰涂片阴性的疑似肺结核患者254例,对其行痰GeneXpertMTB/RIF、痰Hain技术、痰罗氏培养、绝对浓度法药敏试验。以痰罗氏培养结果为金标准,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析GeneXpertMTB/RIF、Hain技术检测痰涂片阴性肺结核的效能;以绝对浓度法药敏试验结果为金标准分析GeneXpertMTB/RIF、Hain技术检测利福平耐药的效能。结果GeneXpertMTB/RIF诊断痰涂片阴性肺结核的敏感度、特异度、准确度分别为82.18%、86.93%、83.52%;Hain技术诊断痰涂片阴性肺结核的敏感度、特异度、准确度分别为67.33%、77.12%、73.23%;GeneXpertMTB/RIF评估利福平耐药性的敏感度、特异度、准确度分别为73.33%、98.84%、95.05%;Hain技术评估利福平耐药性的敏感度、特异度、准确度分别为86.67%、82.56%、83.17%。结论GeneXpertMTB/RIF对痰涂片阴性肺结核的诊断价值及利福平耐药性的评估价值优于Hain技术,GeneXpertMTB/RIF对痰涂片阴性肺结核的快速诊断及治疗具有较好的应用价值。