荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

目的对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价检测能力及在国境口岸的应用价值。方法应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌,以传统药物敏感性试验为标准,获得该方法的灵敏性、特异性。结果对347例结核病人临床分离培养样本,传统药物敏感性试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本。荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏性为93.42%,特异性为97.42%,符合率为96.54%。结论荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌感染的流行特征

目的 应用荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌(NTM)的感染趋势、分布特征、流行状况,为该地区NTM感染的防治提供参考依据。方法 收集2016—2020年间宜昌地区在某院就诊的疑似结核病患者的胸腔积液、腹腔积液、痰、支气管肺泡灌洗液标本,经萋-尼抗酸染色涂片、MGIT 960快速培养和改良罗氏培养检出的所有分枝杆菌阳性标本进一步经荧光PCR熔解曲线法鉴定结核分枝杆菌(MTB)及NTM菌种。以全基因组测序(WGS)为金标准,对比分析荧光PCR熔解曲线法鉴定MTB及NTM的准确性,总结该地区NTM感染患者的临床特征。结果 共收集7 496份分枝杆菌阳性标本,经荧光PCR熔解曲线法鉴定,检出6 997株(93.34%)MTB与499株(6.66%)NTM。NTM菌种鉴定共确定469株(93.99%)NTM菌种,其余30株(6.01%)为未知菌种。检出最多的NTM为胞内分枝杆菌(189,37.88%),其次依次为脓肿分枝杆菌(68株,13.63%)、戈登分枝杆菌(25株,5.01%)。选择荧光PCR熔解曲线法鉴定的22株MTB和18株NTM行WGS,符合率为98.15%,灵敏度为9...     

高分辨率熔解曲线技术检测耐利福平结核杆菌

目的建立1种基于荧光定量PCR扩增原理的联合高分辨率熔解曲线技术(qPCR-HRM),用于耐利福平结核杆菌(RR-TB)的快速检测。方法选取GenBank中结核杆菌rpoB基因序列(利福平耐药决定域),分别设计2对特异性引物rpoB-1R/F、rpoB-2R/F扩增rpoB基因的不同片段,构建荧光定量PCR反应体系,加入HRM饱和荧光染料监测扩增产物进行HRM分析。以H_(37)R_a菌株为阴性对照,检测240株临床诊断肺结核培养菌株对利福平(RFP)的耐药性;以传统的药敏实验结果为金标准,对qPCR-HRM法检测RR-TB的灵敏度、特异度、重复性进行评估。结果 qPCR-HRM法检测RR-TB灵敏度为84.8%,特异度为96.5%,批内、批间变异系数均1%,检测时间为2h以内。结论 qPCR-HRM法检测RR-TB耗时较短、特异度强、灵敏度高、快速易操作,适合在有条件的基层医疗机构进行推广。     

PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药性

目的:建立PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变。方法:用比例法筛选出70株耐利福平结核分枝杆菌临床分离株,用PCR-SSCP方法检测菌株ropB基因突变,并与比例法检测结果进行对比。结果:70株耐利福平菌株中,单耐利福平菌株为12株,同时耐福平和异烟肼菌株为58株。扩增菌株rpoB基因,70株结核分枝杆菌临床分离株ropB基因突变率为91.43%(64/70),其中,耐多药菌株ropB基因突变率为91.38%(53/58),单耐利福平菌株ropB基因突变率为91.67%(11/12)。结论:用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性所用时间大幅缩短,检测出的结果与传统方法一致率高,但结核分枝杆菌表型耐药菌株,存在rpoB基因位点无突变的现象,是否存在其他耐药位点或耐药机制,值得深入研究。     

Gene-Xpert MTB/RiF与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药分析

目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作为金标准进行比较。结果 235例标本中比例法药敏试验利福平耐药12例(5.1%)、Gene-Xpert MTB/RiF利福平耐药例15例(6.4%)、熔解曲线法利福平耐药19例(8.1%),Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法敏感度分别为91.7%和100.0%;特异度分别为98.2%和96.7%。结论Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法两者均可应用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测,Gene-Xpert MTB/RiF法在我国开展结核菌耐多药筛查具更有较强的实用性,有更广的应用前景。     

苏州市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特点的研究

目的 了解苏州市利福平( rifampin,RFP)耐药结核分枝杆菌rpoB基因突变特点,以期为苏州市RFP耐药结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床快速诊断提供有价值的分子标记靶点.方法 通过裂解MTB抽提基因组DNA,采用PCR扩增和DNA测序方法,分析苏州市结核病患者痰培养阳性并经药敏试验诊断为RFP耐药MTB的rpoB基因RFP耐药决定区(rifampin resistance-determining region,RRDR)和CⅡ区变异谱与变异率.将主要突变形式RRDR-531 (TCG→TTG)与传统药敏实验进行诊断学试验,评价此类型突变作为RFP耐药菌株分子标记靶点的临床应用价值.结果 42株RFP耐药MTB的rpoB基因总突变率为90.5％ (38/42),在所检测到的突变中,以RRDR-531 (TCG→TTG)为主要形式(61.9％).以此类型的位点突变作为RFP耐药菌株诊断的分子标记,与传统药敏试验比较进行配对x2检验,结果表明,与敏感菌株相比,RRDR-531(TCG→TTG)突变在RFP耐药菌株中差异有统计学意义(x2=12.51,P＜0.01).结论 rpoB基因RRDR-531(TCG→TTG)突变是苏州市MTB产生RFP耐药性的主要分子机制,其作为RFP耐药MTB诊断的分子标记靶点具有较好的临床应用价值.     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐利福平基因突变的初步研究

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，PCR掺入法荧光标记根据结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断，与DNA芯片杂交，同时以DNA测序法为对照。结果18株结核分枝杆菌临床分离株中，1株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；17株耐RFP临床分离株中有17株检测到rpoB基因突变，其中14株单位点突变，1株511和516位双位点突变，与测序结果完全一致。另有两株为517和518、526和517位双位点突变，因为芯片上未点517位突变的探针，所以只检测到518和526位的突变，该突变与测序结果完全一致、结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变，可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的:了解合肥地区结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药株rpoB基因突变特点。方法:应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的90株结核分枝杆菌的rpoB基因629 bp(包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)的81 bp)序列进行测定分析。结果:90株结核分枝杆菌中69株对RFP耐药,21株对RFP敏感;69株耐利福平临床分离株中53株发生rpoB基因突变,突变率为76.8%;突变发生在531位丝氨酸的31株,发生率为44.9%,发生在526位组氨酸的8株,发生率为11.6%;还有6株发生了联合突变,发生率为8.7%。21株敏感株中1株rpoB基因发生突变,突变位点是533位亮氨酸。结论:合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因的RRDR发生了突变,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

PCR熔解曲线法筛查结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药性

目的 利用PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌(MTB)对链霉素、乙胺丁醇耐药性,并与药敏试验结果比较,评价其应用价值.方法 收集深圳市2007-2009年331株MTB临床分离株,应用PCR熔解曲线法检测embB基因306、378～380、406和497、rpsL基因43、88及rrs基因513～517、905 ～ 908位点耐药突变,并与药敏试验结果比较.结果 以药敏试验结果为标准,PCR熔解曲线法检测MTB链霉素耐药突变的敏感性为78.6％、特异性为90.1％、准确性为86.7％;检测MTB乙胺丁醇耐药突变的敏感性为83.0％、特异性为93.3％、准确性为91.8％.PCR熔解曲线法与药敏试验检测结果具有很好的一致性.结论 PCR熔解曲线法能够快速、特异地检测MTB对链霉素、乙胺丁醇耐药突变,可用于临床筛查.     

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒(探针熔解分析)的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical performance of a probe melting analysis ( PMA)-based real-time PCR detection kit in rapid detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods The specificity of the assay was evaluated by detecting 37 non-tuberculous mycobacteria (NTM) ,and the detection limit of the method was evaluated by genomic DNA of a standard strain H37Rv. Finally, 962 clinical isolates were analyzed with the PMA assay by detecting mutations in rifampin resistance-determining region (RRDR) of rpoB gene, and results were verified with DNA sequencing. Results Among 37 NTM strains,three strains showed drug resistant mutation signals. The PMA method could detect down to 30 bacteria per reaction. Sample analysis showed that 186 of 962 isolates were mutants,751 isolates were wild type and 25 isolates failed to give amplification signals. Among the mutant samples detected, 112 samples from November 2009 to April 2010 were further analyzed by sequencing, as well as 200 wild-type samples. The results showed a complete agreement with the PMA assay except for 5 samples failed in sequence analysis. Conclusion The PMA assay is rapid, accurate and easy-to-use, and thus can be used for detection of rifampin-resistant in clinical isolate samples.     

唐山地区结核分枝杆菌耐药及基因突变特征

目的 了解唐山地区结核分枝杆菌的耐药特征及其药物靶基因位点突变特征。方法 问卷调查193名研究对象的一般情况和疾病相关情况,并分析其特征与分离菌株药敏类型的相关性;抗酸染色和胶体金法确定结核分枝杆菌感染;采用试剂盒鉴定药敏类型;通过测序鉴定靶基因位点突变情况。结果 不同药敏类型菌株宿主的BMI、职业、居住地和抗生素用药史的差异具有统计学意义（P＜0.05）;193株临床分离株对一线、二线药物耐药率为37.31%和75.65%;耐药率排序前三位的药物为阿莫西林（53.37%）、氯法齐明（39.38%）和对氨基水杨酸（25.39%）;总突变率前三位分别为embB 306位点（80.66%）,ropB 531位点（72.62%）和rpoB 526位点（55.36%）;60%的基因位点只测得一种突变类型。结论 唐山地区结核分枝杆菌耐药率较高,药物靶基因位点突变率与其他研究报道相近但突变类型较为单一。     

实时荧光定量PCR检测耐药结核分枝杆菌中耐药相关基因whiB7的表达

目的探讨结核分枝杆菌耐药性与whiB7基因表达水平之间的关系。方法以耐受利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和氟喹诺酮的结核分枝杆菌临床分离株为研究对象,利用实时定量PCR的方法,检测药物刺激结核分枝杆菌后whiB7基因表达水平的变化。结果除利福平刺激相应的菌株后,whiB7基因的表达水平变化不明显外,其余药物的刺激均会引起结核分枝杆菌耐药株的whiB7基因表达水平发生显著变化。结论结核分枝杆菌的whiB7基因是对多种抗生素刺激发生反应的基因,推测whiB7的表达参与结核分枝杆菌的耐药过程。     

福建省46株耐多药结核分枝杆菌katG基因突变特征研究

目的:了解福建省耐多药结核分枝杆菌临床分离株katG基因的突变特点,为建立适合我省快速检测异烟肼耐药方法提供参考。方法:对福建省9个监测点进行耐药性调查,收集菌株经菌种鉴定、药物敏感性试验。选取46株耐多药结核分枝杆菌和15株全敏感株,扩增katG高突变区域的基因片段,测序后比对分析。结果:15株全敏感株未检测氨基酸突变。46株耐多药结核分枝杆菌katG基因的突变率为80.43%,katG 315的突变率为54.35%,联合突变率为52.17%。结论:福建省耐多药结核分枝杆菌杆不同耐药谱katG基因突变率不同,最常见的点突变发生于315位,463位具有等位基因多态性。     

鄞州区结核分枝杆菌耐药性研究

目的了解鄞州区肺结核患者结核分枝杆菌的耐药水平,为本区的结核病诊治提供参考依据。方法对鄞州区疾病预防控制中心2008—2009年收集的结核分枝杆菌用WHO推荐的比例法进行异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)和乙胺丁醇(E)的耐药性检测。结果 299例初复治患者的痰培养分离的结核分枝杆菌,总耐药率为30.77%,初始耐药率和获得性耐药率分别为27.48%和54.05%;耐多药率为6.69%,其中初始和获得性耐多药率分别为4.20%和24.32%。4种抗结核药物的耐药率由高到低分别为异烟肼(19.40%)、链霉素(16.05%)、利福平(9.36%)和乙胺丁醇(6.02%)。不同性别、年龄、户籍的耐药率差异无统计学意义。结论鄞州区结核病耐药形势依然严峻,应继续加强结核病的防治工作。     

嘉兴市２７７株结核分枝杆菌耐药性监测分析

摘要：目的　了解结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药性,初步评价嘉兴市近年来结核病的耐药趋势。
方法　对嘉兴市第一医院２００９－２０１１年期间的结核病患者培养阳性菌株进行菌群鉴定及采用比例法对４种
一线抗结核药物异烟肼（Ｈ）、利福平（Ｒ）、链霉素（Ｓ）、乙胺丁醇（Ｅ） 进行药物敏感性测定,用ＳＰＳＳ
１７．０统计软件进行χ
２ 检验,分析结果。结果　本研究共纳入结核分枝杆菌２７７株,总耐药率为２７．０８％,
耐多药率为１１．１９％;初治患者和复治患者耐药率分别为１７．６２％和５６．７２％,耐多药率６．１９％和２６．８７％,
两者差异均有统计学意义（χ
２＝４．９６,犘＝０．０２６;χ
２＝２１．８５,犘＜０．０１）。结论　嘉兴市结核分枝杆菌的
耐药情况依然严峻,尤其复治患者,在制定结核病防控策略时应给予充分重视,加强对复治肺结核患者高
质量的全程监督短程化疗。
关键词：结核分枝杆菌;耐药性;分析
中图分类号：Ｒ３７８．９１＋１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０６ ０５５０ ０３     

烧伤瘢痕癌治疗分析

目的 探讨烧伤瘢痕癌的临床特点与治疗方法。方法 回顾性分析8例烧伤瘢痕癌患者的临床资料。结果 8例烧伤瘢痕癌均为鳞状细胞癌，其中6例为Ⅰ级，2例为Ⅱ级。其中溃疡型6例，菜花型2例。手术植皮或皮瓣均成活。8例患者分别于术后4个月至5年获得随访，2例烧伤瘢痕癌患者术后8个月复发，行二次手术植皮，其余6例局部无复发，功能外形好。结论 病理检查结果是确定诊断与治疗方案的重要依据，手术仍是烧伤瘢痕癌的首选治疗方法。     

胃大部切除术后患者对结核分枝杆菌易感性分析

目的探讨胃大部切除术后患者对结核分枝杆菌易感性的原因。方法回顾性分析42例胃大部切除术后结核病患者(有手术史组)的临床资料,并以同期50例无胃大部切除术的结核病患者作为对照(无手术史组)。结果有手术史组:肺结核37例,肠结核4例,骨结核1例;治疗好转出院41例,死亡1例。无手术史组:肺结核47例,肠结核2例,肾结核1例;均治疗好转出院。T细胞亚群:有手术史组CD4+T细胞为0.34±0.05和CD8+T细胞为0.29±0.06,无手术史组分别为0.44±0.09和0.25±0.11,两组比较差异有统计学意义(P<0.01或<0.05)。结论胃大部切除术后患者细胞免疫功能低下,容易感染结核分枝杆菌,是结核病的高危人群,应引起注意。