不同培养基对海马脑片活性及微管相关蛋白tau表达的影响

目的探讨在不同培养基条件下,不同年龄大鼠的海马脑片在长期培养过程中的活性改变及微管相关蛋白tau表达的动态变化.方法制备1、2、4和8周龄雄性Wistar大鼠海马脑片(400μm),分别使用minimum essential medium(MEM)和Dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture(DMEM/F12)两种不同的培养基进行培养.在培养的21 d内以乳酸脱氢酶(LDH)法监测不同培养基条件下海马脑片活性的改变,并在不同时间点选取脑片以免疫印迹法检测tau蛋白含量的改变.结果在海马脑片的长期培养过程中,两种培养基对脑片活性的影响差异无显著性,而培养基DMEM/F12可使脑片中的tau蛋白更持久、更高量地稳定表达,尤其是2和4周龄鼠源海马器官型脑片.结论选取2或4周龄大鼠,应用培养基DMEM/F12更适合于脑片水平tau蛋白的相关研究,在此基础上可望建立阿尔茨海默病理想研究模型.     

P301L突变tau蛋白转基因动物模型及其应用

微管相关蛋白tau在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等多个tau蛋白病(tauopathies)的发病机制中发挥重要的作用,并且得到了越来越多的关注。在tau蛋白病的研究中,理想的tau蛋白病变模型对于发病机制和药物治疗的研究具有重要的意义。目前国内外学者已经建立了多个tau蛋白转基因动物模型,其中过表达P301L突变tau蛋白的动物模型因具有明显的病理改变而得到广泛的应用。本文综述了P301L突变tau蛋白转基因动物模型的病理表现及在药理研究中应用的新进展。     

微管相关蛋白tau与AD神经原纤维损伤

Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ（ＡＤ）是老年人群中常见的、严重影响老年人身心健康的一种疾病,该病最特征性变化之一是神经细胞内神经原纤维缠结（ＮＦＴ）的基本结构双股螺旋细丝（ＰＨＦ）的大量沉积,而痴呆与ＰＨＦ沉积的关系非常密切。已知ＰＨＦ中的主要...     

微管蛋白及磷酸化tau蛋白在认知功能障碍疾病中的作用

认知功能障碍是指脑的器质性病变所造成的患者在知觉、注意、言语、记忆以及思维等高级皮层机能方面出现的机能障碍。很多疾病可造成认知功能损害,如缺氧性脑病、阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）、脑血管病等。这些疾病引发认知功能障碍的具体机制尚不明确。研究显示,出现认知功能障碍疾病患者的神经中枢都存在不同程度的细胞凋亡、细胞退变,在这些无功能细胞中可见微管蛋白、磷酸化tau蛋白异常改变。本文主要对认知功能障碍疾病中微管蛋白、磷酸化tau蛋白改变的研究现状作一综述。     

Ⅲ型β-微管蛋白?微管相关蛋白tau及凋亡抑制蛋白survivin的mRNA水平与胃癌对紫杉醇敏感性的研究

目的:探讨胃癌细胞中Ⅲ型β-微管蛋白(Class Ⅲ β-tubulin)?微管相关蛋白tau(MAPT)和凋亡抑制蛋白survivin的表达水平对化疗药物紫杉醇敏感性的预测价值?方法:采用ATP生物荧光法检测54例胃癌原代细胞对紫杉醇的体外药物敏感性,RT-PCR法检测胃癌细胞内Class Ⅲ β-tubulin?MAPT和survivin的mRNA表达水平,分析胃癌细胞对紫杉醇的体外敏感性与上述生物学指标表达水平的关系?结果:Class Ⅲ β-tubulin的mRNA表达水平为1.04 ± 0.22,与分化程度有关(P = 0.029);MAPT的mRNA表达水平为0.80 ± 0.17;survivin的mRNA表达水平为1.00 ± 0.19,与分化程度有关(P = 0.009)?药敏指数与Class Ⅲ β-tubulin表达水平呈负相关(r = -0.372,P = 0.006),与MAPT表达水平呈负相关(r = -0.292,P = 0.032),与survivin表达水平呈负相关(r = -0.340,P = 0.012);Class Ⅲ β-tubulin与MAPT mRNA表达水平呈正相关(r = 0.284,P = 0.037),与survivin mRNA表达水平呈正相关(r = 0.559,P = 0.000)?结论:胃癌细胞中Class Ⅲ β-tubulin?MAPT和survivin的表达水平可能对紫杉类药物的化疗敏感性具有较好的预测价值?     

蛋白激酶5与微管相关蛋白tau磷酸化的关系

阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）是一种以进行性痴呆为特征的神经退行性疾病,以严重的记忆减退和认知障碍为主要临床表现。目前有关AD的发病机制尚不甚明了。过度磷酸化的tau蛋白组成的神经原纤维缠结（NNF）是AD的主要神经病理学特征之一。细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase 5,edk 5）主要在神经系统中激活,是脑发育、神经定位、突触发生与传递的重要调节因子,参与了AD病人脑内tau蛋白的异常磷酸化,在AD的发病过程中可能发挥重要作用。本文简要介绍cdk5的结构及其分布部位,tau蛋白的结构与功能,对cdk5对微管相关蛋白tau磷酸化的关系进行了初步的探讨,为临床防治AD提供一些新的思路。     

微管相关蛋白与肿瘤关系的研究进展

微管是由微管蛋白及微管辅助蛋白组成的中空管状结构,在细胞增殖、分化、迁移和肿瘤的发生中具有十分重要的作用。近年来研究表明,大多数肿瘤细胞中某些微管相关蛋白的异常表达引起微管动态系统的失衡,对肿瘤的发生发展起关键作用,因而成为肿瘤研究的热点。文中就微管相关蛋白与肿瘤的关系作一综述。     

冈田酸所致微管相关蛋白tau Ser396位点过度磷酸化抑制细胞凋亡

目的 探讨磷酸酯酶活性降低致tau过度磷酸化与细胞凋亡的关系.方法 稳定表达人tau eDNA的鼠成神经瘤细胞(N2a/tau)分3组.对照组不处理;十字孢碱(staurosporine,STP,凋亡诱导剂)处理6 h为STP组;用磷酸酯酶PP-2A的抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)处理4 h,再用STP处理6 h为OA+STP组.流式细胞仪检测凋亡率,免疫印迹检测Ser396位点磷酸化tau(Ser396 p-tau)和总tau的表达,免疫荧光双标检测Ser396 p-tau的阳性产物与活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase-3)阳性产物的共定位关系.结果 ①凋亡率:对照组为(4.37±1.47)%,STP组为(19.84±3.25)%,OA+STP组为(12.12±2.46)%;②免疫印迹:OA+STP组Ser396 p-tau的表达明显高于另两组,总tau表达组间无差异;③免疫荧光双标:进一步印证免疫印迹结果,且3组均显示活化的Caspase-3和Ser396 p-tau阳性产物大多不共定位于相同细胞.结论 PP-2A活性降低所致tau Ser396位点的过度磷酸化可抑制细胞凋亡,结合前期的实验进一步明确特殊位点过度磷酸化的tau可抑制细胞进入快速的凋亡程序.     

微管相关蛋白与自噬的研究进展

微管相关蛋白和微管蛋白共同控制微管的组装和稳定性,进而调控一些重要的生理过程,例如:调节细胞物质运输,维持细胞形态,细胞分裂分化,肿瘤的发生及自噬的发生.本综述将重点关注于微管相关蛋白与自噬之间的联系.     

β3-微管蛋白及tau蛋白的表达在乳腺癌紫杉类药物化疗耐药中的预测价值

目的：探讨乳腺癌β3-微管蛋白及微管相关蛋白tau的表达与紫杉类药物化疗耐药的相关性.方法：对48例进展期乳腺癌患者采用含紫杉类药物化疗方案进行2～6个周期新辅助化疗,应用空芯针穿刺技术获取化疗前及化疗后的第2、第4、第6周期末乳腺癌组织标本.免疫组织化学法分别检测β3-微管蛋白及tau蛋白的表达水平,探讨化疗疗效与β3-微管蛋白及tau蛋白表达的相关性.结果：化疗前β3-微管蛋白的平均表达率为45.6％±33.3％,tau蛋白平均表达率为62.9％±24.3％,化疗总体有效率为60.4％.β3-微管蛋白表达与紫杉类药物化疗有效率呈负相关,在化疗的第2、第4、第6疗程末,β3-微管蛋白的平均表达率分别为51.6％±31.2％,54.6％±29.1％,57.8％士30.4％,表达呈上升趋势,并在第4疗程获得了统计学的差异.tau蛋白表达与雌激素受体表达存在正相关,与化疗有效率之间无显著相关.tau在化疗前后表达无显著改变.结论：β3-微管蛋白是良好的紫杉类化疗敏感性预测因子,并且可能是紫杉类继发耐药发生的重要原因,在化疗前及化疗过程中检测其表达情况有助于化疗方案的选择.tau蛋白可能并不是一个良好的紫杉类化疗敏感性预测因子.     

微管相关蛋白Tau蛋白及Tau病的研究进展

Tau蛋白是微管相关蛋白家族的主要成员,其磷酸化水平的增高与多种中枢神经系统疾病密切相关,如阿尔茨海默病(Alzeimer's disease,AD)、癫痫、额颞叶痴呆、皮质基底节变性(corticobasal degeneration,CBD)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy,PSP)、朊蛋白病等.Tau病是以异常磷酸化Tau蛋白聚集为病理特点的年龄相关性神经变性病.Tau病根据微管相关蛋白Tau(microtubule-associated proteins tau,MAPT)基因剪切不同分为6种同型异构体,外显子9、10、11、12各编码一个微管结合模序氨基酸重复序列,有外显子10编码氨基酸序列的Tau蛋白异构体为4R,其他的异构体为3R.皮克病(Pick's disease,PiD)中3R占优势,而皮质基底节变性和进行性核上性麻痹中4R占优势,根据MAPT中基因突变的位置,额颞叶痴呆FTLD-tau可以出现3R、4R或二者均有.本文综述了近年来在Tau蛋白及Tau病相关领域的研究进展.     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

体外培养的人脐血单个核细胞MAP2及τ蛋白mRNA的表达

目的:探讨脐血单个核细胞(MNCs)体外培养前后微管相关蛋白2(MAP2)和τ蛋白mRNA的表达.方法:用密度梯度离心法分离脐血MNCs,分组培养.对照组不加任何细胞因子,细胞因子组加入EGF和bFGF,终浓度均为20μg/L,每3 d半量换液1次,共14 d.倒置显微镜下观察培养过程中细胞形态的变化,RT-PCR法检测脐血MNCs培养前后τ蛋白及MAP2 mRNA的表达.结果:培养前,脐血MNCs胞体小呈圆形.培养后细胞因子组细胞胞体较大,有粗长突起形成,类似神经元;对照组细胞胞体较小,突起较短、较细,形似星形细胞.培养前脐血MNCsτ蛋白mRNA阴性表达,而MAP2 mRNA表达阳性;培养后2者均表达阳性,且细胞因子组2者阳性表达强于对照组(P＜0.05).结论:脐血MNCs表达MAP2 mRNA,经培养后同时表达τ蛋白mRNA,细胞因子能增强2者的表达.     

外源性脑源性神经营养因子通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡

目的 观察外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对tau蛋白过磷酸化及神经元凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.方法 将培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)分为正常对照组;冈田酸(OA)组:浓度为40 nmo/L的OA处理24 h;BDNF组:OA处理24 h后加入浓度为50 ng/mL的BDNF处理15 min;LY294002组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及LY294002(40 nmol/L)共同处理15 min;K252a组:OA处理24 h后加入BDNF(50 ng/mL)及K252a (40 nmol/L)共同处理15 min.通过MTT检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Western blot检测Ser199/202、pSer199/202及bcl-2表达.结果 MTT 实验显示OA组、LY294002组及K252a组细胞存活率较正常对照组及BDNF组明显减低(P＜0.01);BDNF组与正常对照组无明显差异(P＞0.05).流式细胞仪检测显示OA组、LY294002组及K252a组细胞凋亡率较正常对照组及BDNF组明显增加(P＜0.01);BDNF组与正常对照组之间无统计学差异(P＞0.05).Western blot显示OA组、LY294002组及K252a组pSer199/202表达较正常对照组及BDNF组明显增多(P＜0.01),Ser199/202及bcl-2表达较对照组及BDNF组明显减少(P＜0.01),BDNF组与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05).结论 外源性BDNF可通过抑制tau蛋白磷酸化减少细胞凋亡.     

大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定

目的构建大鼠微管相关蛋白4(m icrotubu le-ossoc iated prote in 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础。方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒。将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Ad-eno-X V iru l DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒。并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定。结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/m l。转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强。结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础。     

激素性股骨头坏死动物模型建立方法初探

目的:研究激素性股骨头坏死(steroid induced necrosis of femoral head,SNFH)动物模型的建立方法.方法:12只健康雄性新西兰白兔随机分成甲基泼尼龙组(M组)、甲基泼尼龙+抗生素组(MA组)和对照组(C组),M组和MA组均每周2次,每次肌注甲基泼尼龙琥珀酸钠 8 mg/kg,MA组每只每周2次青霉素40万 U(0.24 g)肌注,经常性增加动物后肢受力的负荷,激素注射8周后进行股骨头CT和组织病理检查,观察造模效果.结果:M组在激素注射后5周内全部死亡,MA组建模期间全部存活.CT显示MA组无特征性股骨头坏死表现,但局部结构模糊不清,有高亮度影.MA组病理检查肉眼可见股骨头软骨面局部缺损,坏死面暴露,髓腔内大量脂肪组织堆积;光镜下成骨细胞、骨细胞均减少,空骨陷窝增多,微小血栓广泛分布,变形扩大的脂肪细胞挤压正常骨髓组织细胞,骨小梁变细破裂明显.结论:本实验建立SNFH动物模型的方法有效,建模过程必须同时给予适量的抗生素类药物预防感染,CT作为早期股骨头坏死(necrosis of femoral head, NFH)影像学观察和评价手段有一定局限性.     

关节镜下半月板部分切除制备骨关节炎动物模型

目的 探讨经关节镜建立猪双膝骨关节炎动物模型及用磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)监测骨关节炎骨软骨损害的有效性和可行性.方法 4只小型猪经关节镜切除双膝外侧部分半月板,术后12周,行大体、组织学和MRI观察与切除半月板相对股骨髁的骨软骨变化.结果 大体观察结果显示,局限性软骨表面纤维化,股骨髁间切迹骨赘形成;组织学检测结果显示,软骨细胞数量和蛋白多糖含量减少、成簇排列细胞数量增加;MRI检查结果显示,软骨厚度变薄和骨软骨信号强度改变.结论 经关节镜半月板部分切除能有效建立猪双膝关节骨关节炎动物模型,MRI能灵敏地监测到骨关节炎动物模型的骨软骨变化.     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

大鼠急性脊髓损伤后tau蛋白表达规律及意义

目的：探讨急性脊髓损伤后Wistar大鼠脊髓组织中tau蛋白动态表达规律及意义.方法：健康Wistar大鼠56只,雌雄不限随机分为两组,其中1组用改良Allen法制备成急性脊髓损伤模型,即作为手术组（48只）;另1组则作为对照组（对照组仅开椎板,不损伤大鼠脊髓组织n=8）.分别在12h、1d、3d、5d、7d、10d取出大鼠在T10及部分T9、T11椎板下的损伤脊髓组织制作蜡块并切片.采用HE染色及免疫组化法测定大鼠脊髓损伤后受损脊髓组织中tau蛋白的表达.结果：Wistar大鼠在急性脊髓损伤后,受损脊髓组织内即出现tau的阳性表达,随着时间的延长,tau蛋白的阳性表达结果逐渐增多;伤后3d阳性表达到达最大表达值,10d表达仍呈阳性且高于对照组.结论：损伤大鼠的脊髓组织后,组织中tau蛋白表达明显增加,且在不同时间点上有一定的变化关系,为急性脊髓损伤后临床的早期干预时机提供了一定的理论依据.