Ki67基因RNA干扰腺病毒表达载体的构建及其抗结肠肿瘤作用研究

目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。     

腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定北大核心CSCD

目的构建一种高效"沉默"碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料。方法设计、合成优选的靶向bFGF特异性siRNA序列。采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA。鉴定正确后经Pac Ⅰ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA。同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果。结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90%。结论应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础。     

人类nm23-H1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人肿瘤转移抑制基因nm23-H1的重组腺病毒载体。方法通过PCR方法以pcDNA3．1-nm23-H1为模板扩增出编码152个氨基酸的nm23-H1基因,并连接入穿梭质粒 pShuttle-CMV。将含有目的基因的重组穿梭质粒pShuttleCMV-nm23-H1经Pme I线性化后转化入 AdEasier-1感受态细胞,用含硫酸卡那霉素的LB培养基筛选重组子,并用PCR及酶切方法鉴定。鉴定正确的pAd-nm23-H1质粒经Pac I线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-nm23- H1,并进行PCR鉴定及病毒滴度测定。结果 PCR、酶切鉴定及测序结果证实pShuttleCMV-nm23- H1及pAd-nm23-H1质粒正确构建,收获病毒后的PCR鉴定及DNA测序结果证明Adeno-nm23- H1包被成功且无野生型腺病毒产生。重组腺病毒Adeno-nm23-H1滴度为4．3×109／ml。结论成功构建了重组腺病毒载体Adeno-nm23-H1,为进一步研究nm23-H1抑制肿瘤转移分子机制及基因治疗奠定了基础。     

人类nm23-H1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建人肿瘤转移抑制基因nm23-H1的重组腺病毒载体.方法通过PCR方法以pcDNA3.1-nm23-H1为模板扩增出编码152个氨基酸的nm23-H1基因,并连接入穿梭质粒pShuttle-CMV.将含有目的基因的重组穿梭质粒pShuttleCMV-nm23-H1经Pme Ⅰ线性化后转化入AdEasier-1感受态细胞,用含硫酸卡那霉素的LB培养基筛选重组子,并用PCR及酶切方法鉴定.鉴定正确的pAd-nm23-H1质粒经Pac Ⅰ线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-nm23-H1,并进行PCR鉴定及病毒滴度测定.结果PCR、酶切鉴定及测序结果证实pShuttleCMV-nm23-H1及pAd-nm23-H1质粒正确构建,收获病毒后的PCR鉴定及DNA测序结果证明Adeno-nm23-H1包被成功且无野生型腺病毒产生.重组腺病毒Adeno-nm23-H1滴度为4.3×109/ml.结论成功构建了重组腺病毒载体Adeno-nm23-H1,为进一步研究nm23-H1抑制肿瘤转移分子机制及基因治疗奠定了基础.     

HBx基因重组腺病毒载体构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:利用pAdEasy1腺病毒载体系统构建人HBx基因重组腺病毒,感染肝癌细胞株SMMC7721使HBx基因有效表达。方法:自真核表达载体pcDNA3.1(-)HBx中获得HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中构建pAdTrackCMVHBx,然后经PmeⅠ酶切线性化,电转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中。挑选和鉴定正确的同源重组质粒,然后将线性化的重组质粒转染293N细胞,产生重组病毒颗粒,并进一步感染SMMC7721细胞株。结果:经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pAdTrackCMVpAdEasy1HBx重组成功,借助荧光显微镜可以观察到绿色荧光蛋白GFP在293N和SMMC7721细胞株中表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,并在SMMC7721细胞中使HBx基因有效表达,为后续研究奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白和人类血管内皮生长因子的shRNA重组腺病毒的构建与鉴定

 【摘要】　目的　构建表达绿色荧光蛋白（GFP）和人类血管内皮生长因子（VEGF）的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对人类鼻咽癌细胞系CNE的感染效果。方法　使用基因工程技术将GFP和人类VEGF siRNA的cDNA通过LR法体外同源重组从质粒载体pGenesil-1上转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGSadeno-GFP-VEGF,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293细胞,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带的GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对CNE细胞感染效率的检测。结果　酶切鉴定及PCR结果证明GFP-VEGF shRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达到2×109 PFU／ml,对CNE有较强的感染能力,感染腺病毒后CNE细胞的增殖速率明显下降。结论　应用体外同源重组方法成功构建了表达GFP和VEGF shRNA的重组腺病毒载体。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的：构建白细胞介素7（IL-7）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法：将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果：pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论：pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010pfu/ml。结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定

目的 构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒.方法将hIL-2 DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α.得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,再次转化大肠杆菌DH5α,挑取正确克隆,大量扩增,提取质粒.将此质粒经PacⅠ酶切后与LipofectamineTM 2000转染HEK293细胞,产生含人IL-2的复制缺陷重组腺病毒(AdhIL-2).结果 pLP-Adeno-hIL-2重组载体经PCR、酶切鉴定结果与预期相符,所得重组病毒滴度达到5×107 PFU/ml.结论成功构建了hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒.     

rAAV-Slug-siRNA载体的构建及其抗胰腺 癌的实验

 目的构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA（Slug-siRNA）病毒载体,探讨Slug干扰抗 胰腺癌作用。方法首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆 为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收PCR产物; 酶切pSNAV2.0-lacz-α载体质粒, 并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测 序对其进行鉴定。建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA, 大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴 定和滴度测定。将体外培养的胰腺癌细胞株AsPC-1转染Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体。Western blot及RT-PCR方法鉴定转染前后AsPC-1细胞内PUMA及Slug蛋白及mRNA表达,MTT比色法检测细胞存活率, TUNEL检查细胞凋亡。结果携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0- EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确。将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹 病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒Slug-siRNA,经检测目的片 段插入成功,滴度为9.23×1010(puf)。Slug-siRNA有效抑制AsPC-1细胞内Slug表达,抑制体外细胞增殖 ,促进细胞凋亡,同时,伴随着Slug表达的下降,细胞内PUMA表达明显增加。结论成功制备出高滴度携带 目的基因的Slug-siRNA病毒载体。干扰Slug表达抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过解 除Slug对PUMA基因的抑制有关。