问号钩端螺旋体属特异性LipL41s抗原膜定位及其患者血清抗体检测

目的确定问号钩端螺旋体（钩体）属特异性脂蛋白抗原LipL41s膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型。方法采用显微镜凝集试验（MAT）检测四川地区钩体病患者血清标本。IPTG诱导重组原核系统表达目的蛋白rLipL41／1和rLipL41／2，Ni—NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物。采用Westernblot检测感染不同血清群问号钩体病患者血清与rLipL41s的免疫反应性。采用胶体金免疫电镜技术，对LipL41s进行膜定位。建立基于rLipL41s的ELISA，检测钩体病患者血清中特异性抗体水平及其类型。结果黄疸出血群是四川地区最主要的优势钩体血清群。不同血清群问号钩体病患者血清均能有效识别LipL41s。LipL41s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。156例MAT阳性钩体病患者血清标本中，rLipL41／1和rLipL41／2特异性IgM阳性率分别为84．6％～87．8％和78．2％～83．3％，特异性IgG阳性率分别为69．2％～81．4％和75．0％～80．1％。结论LipL41s是钩体表面蛋白抗原。自然感染钩体时，LipL41／1和LipL41／2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体，且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rLipL41／1和rLipL41／2可作为研制通用型钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。     

问号钩端螺旋体lipL41基因表达及重组抗原分析

目的构建问号钩端螺旋体（钩体）ltB／ctB-lipL41／1融合基因及其原核表达系统。方法采用连接引物聚合酶链反应（PCR）构建ltB—lipL41／1和ctB—lipL41／1融合基因，常规方法构建其原核表达系统。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的重组蛋白rLTB—rLipL41／1和rCTB—rLipL41／1表达情况；用免疫印迹和神经节苷脂-酶联免疫吸附试验（GM1-ELISA）分别检测上述目的重组蛋白的免疫原性和佐剂活性；采用PCR和显微镜凝集试验（MAT）分别检测97株问号钩体野生株lipL41／1基因及其表达情况；用ELISA检测228例钩体患者血清lipL41基因产物的抗体。结果与报道的相关序列比较，ltB—lipL41／1和ctB—lipL41／1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．6％～99．9％和99．8％～100％。rLTB—rLipL41／1和rCTB—rLipL41／1表达产量均约为细菌总蛋白的10％，主要以包涵体形式存在。rLTB—rLipL41／1和rCTB—rLipL41／1均分别能与rLipL41／1兔抗血清和牛GM1结合。87．6％（85／97）问号钩体野生株含有lipL41基因，84．5％（82／97）问号钩体野生株分别与rLipL41／1和rLipL41／2免抗血清出现效价范围为1：4～1：128的MAT阳性结果。84．6％（193／228）和78．5％（179／228）的患者血清分别rLipL41／1和rLipL41／2抗体阳性。结论成功地构建了ltB—lipL41／1和ctB-lipL41／1融合基因及其原核表达系统。所表达的rLTB-rLipL41／1和rCTB-rLipL41／1融合蛋白有良好的免疫原性和佐剂活性。lipL41基因存在于不同问号钩体血清群中并高频率表达。rLTB—rLipL41／1和rCTB—rLipL41／1具有成为钩体属特异性疫苗抗原的良好前景。     

以重组融合蛋白为基础的钩端螺旋体酶联免疫吸附试验检测试剂盒的初步研制

目的 建立以钩端螺旋体融合蛋白LipL32-LipL41(LipL32:脂蛋白L32,lipoprotein32;LipL41:脂蛋白L41,lipoprotein41)为包被抗原的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂。方法 选择问号钩端螺旋体LipL32和LipL41作为研究靶标,采用连接引物PCR法构建lipL32-lipL41融合基因,原核表达获得重组蛋白,以该蛋白为包被抗原建立ELISA检测体系,对检测体系的灵敏度、特异性、稳定性等性能指标进行评价。结果 扩增获得了1 900 bp左右的lipL32-lipL41融合基因,原核表达出了90 kDa左右的重组融合蛋白LipL32-LipL41,建立了基于LipL32- LipL41的ELISA检测体系,采用77例确诊病例和85例阴性对照血清进行初步验证,检测体系的灵敏度为96.1%,特异度为97.6%,粗一致性为96.9%,约登指数为0.937。结论 以LipL32-LipL41重组融合蛋白为包被抗原建立ELISA免疫检测初步验证的灵敏度、特异性和稳定性较好,可进行下一步验证工作。     

应用纯化重组外膜脂蛋白LipL32检测钩端螺旋体病抗体

目的 建立以纯化重组外膜脂蛋白LipL32为基础的钩端螺旋体(钩体)病抗体的检测方法 .方法 以摹因重组技术获取重组钩体外膜脂蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,分别使用间接法和夹心法ELISA应用于不同人和鼠血清的检测,检测结果 与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较,同时人血清的检测结果 还与进口试剂盒比较.结果 纯化的重组蛋白检测9例钩体确诊病例双份血清标本,三种ELISA法的检出率与MAT无明显差别.检测45份MAT阳性标本,间接法ELISA敏感性为71.11%(32/45),夹心法ELISA为80.00%(36/45),而进口 ELISA阳性13份,占28.89%(13/45),25份可疑占55.56%(25/45).特异性检测,MAT阴性血清69份,间接和夹心法ELISA特异度均为97.10%(67/69),其中检测门诊体检血清43份,间接和夹心法ELISA均为阴性,进口ELISA检测14份,也为阴性.检测非钩体发热病例血清标本16份,间接和夹心法ELISA共检出2份阳性,进口ELISA则是1份阳性,12份可疑.检测梅毒螺旋体质控阳性血清10份,四种方法 均为阴性.重组蛋白检测鼠血清标本274份,夹心法ELISA的敏感性为86.75%(131/151),特异性为99.19%(122/123),符合率为92.34%(253/274),与MAT检测结果 相符.结论 重组LipL32蛋白具有结合活性,可应用于钩体血清抗体的检测,其中夹心法ELISA对鼠血清钩体抗体的检测显示较好的敏感性和特异性,适用于钩体病现场血清流行病学大样本调查.     

钩端螺旋体毒力相关基因的分布特点分析

目的 探讨钩端螺旋体(钩体)毒力相关基因的分布特点。方法 根据钩体赖型赖株全基因组序列的生物信息学分析资料，选择了12个可能与钩体毒力相关的基因，采用聚合酶链反应(PCR)方法，对中国问号钩体38株参考菌株和81株分离的野生菌株，以及12株非致病性的双曲钩体共131株菌株进行了检测。结果 问号钩体中各毒力相关基因分布广泛，双曲钩体中仅检测到个别毒力相关基因。lipL32基因存在于所有检测的问号钩体，lipL36基因在问号钩体不同菌株中的变异较大，阳性检测率为0％～90．91％；lal608基因在问号钩体黄疸出血群菌株中阳性检测率为87．50％，而在其他血清群菌株间阳性检测率为0％～25．00％，sphA基因仅在问号钩体少数菌株中能检测到，阳性检测率为17．65％，且在中国赛罗群哈焦型参考菌株中未检测到。结论 这些基因可能是问号钩体重要的毒力相关基因。其中lipL32可能是问号钩体各血清群菌株共同抗原的编码基因；lipL36基因可能和问号钩体血清群特异性和多样性有关；lal608基因可能是黄疸出血群菌株特有的基因；哈焦型菌株与问号钩体菌株在基因结构具有较大的差异。     

lipL32—PCR应用于钩端螺旋体检测

目的探讨lipL32-PCR检测方法对钩端螺旋体（钩体）检测的可行性。方法根据外膜脂蛋白基因（@L32）设计引物,与卫生行业标准推荐的引物G1／G2对比,进行特异性与灵敏度研究,并应用于常山县蛙、鼠肾脏标本钩体PCR检测;对浙江省2008年分离菌株进行钩体PCR鉴定。结果lipL32-PCR具有较高的灵敏度和特异性,该引物可特异性扩增致病性钩体DNA,对本实验所用的其他细菌不扩增。2008年分离的钩体菌株PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符;鼠和蛙肾标本进行liL32-PCR和卫生行业标准的G1／G2PCR检测,结果两法符合率为95．0％;lipL32-PCR检测阳性率为10．0％,G1／G2-PCR检测阳性率为5．0％,采用精确计算概率法进行阳性率比较,二者差异无统计学意义（尸：0．25）。结论liL32-PCR检测方法可灵敏、特异地检测致病性钩体,能正确有效地反映野生动物带菌率,为控制钩体病提供依据。     

问号状钩端螺旋体外膜蛋白Loa22的克隆、表达及对豚鼠的免疫保护作用研究

目的构建问号状钩体强毒赖型56601株外膜蛋白Loa22的重组质粒,表达Loa22蛋白,研究该蛋白对豚鼠的保护作用。方法以问号状赖型钩体56601株基因组为模板扩增目的基因,将Loa22基因克隆至原核表达载体PQE-31,构建PQE31-Loa22重组体,将其转入大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。于0、2、4周将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下免疫豚鼠。每次剂量为蛋白50μg/只,末次免疫后2周,用培养3d的56601株钩体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1ml/只)。连续观察15d,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。结果成功扩增出Loa22基因,构建原核重组质粒PQE31-Loa22。重组质粒能在大肠杆菌M15中高效表达Loa22蛋白。用Loa22蛋白主动免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,结果显示无发病现象,而免疫对照组的豚鼠中出现了食欲不振、活动减少等现象,病理切片有明显改变。结论成功构建了Loa22重组原核表达质粒,表达纯化的蛋白可以使豚鼠抵抗同型钩体的攻击,免疫保护作用为82%。     

四川省钩端螺旋体毒力相关基因研究

研究四川省问号钩端螺旋体（简称钩体）中毒力相关基因分布特点,为防治钩体病提供科学依据。方法根据钩体赖型赖株全基因组序列生物信息学资料,选择7个钩体致病相关基因与群特异性G1、G2基因,采用聚合酶链反应（PCR）,对四川省1970-2010年分离保存的问号钩体90株和对照用双曲钩体4株,共94株进行了检测。结果90株问号钩体中7个毒力相关基因,除sphA基因检出率较低外（6．67％）,其余6个毒力相关基因检出率在81．1％～98．9％之间,G1、G2基因检出率为100％,双曲钩体中未检测出7个毒力相关基因和G1、G2基因。结论四川省问号钩体中毒力相关基因分布广泛,检出率高,患者分离株与黑线姬鼠分离株毒力相关基因分布高度一致。     

90年代鄂西北地区钩端螺旋体病流行病学研究

目的：调查鄂西北地区90年代钩端螺旋体（简称钩体）病流行情况。方法：病人血清检测采用MAT和Dot-ELISA法。健康人群免疫水平检测采用MAT法,传染源调查用夹夜法捕鼠,培养鼠肾和猪肾皮质,分离钩体并鉴定钩体菌群。结果：90年代前鄂西北地区很少发生钩体病,90年代后,该地区竹溪,竹山,襄阳,宜城等县市发生钩体病964例,占该地区40年总发病数的88．93％,钩体病暴发时间主要集中在9－10月,钩体病人临床类型以流感伤寒型和肺出血型为主,分别占调查总数的70．47％和21．12％,鼠密度3．62％,鼠带菌率14．37％,健康人群血清抗体阳性率41．50％,结论：钩体病人感染菌群以黄疸出血群为主,与当地鼠,猪感染的钩体菌群一致。     

1991—2006年常山县钩端螺旋体病疫情与监测分析

目的了解常山县钩端螺旋体（钩体）病的流行特征，为制定防治对策提供科学依据。方法用描述性流行病学方法对1991—2006年常山县钩体病的流行特征进行分析，采用患者和宿主动物病原学、血清学检测方法探索主要的流行菌群。结果1991-2006年常山县钩体病平均发病率为19．29／10万，以中青年农民为主，男性高于女性；79月为发病高峰，流行形式主要呈稻田型。检出钩体菌株36株，以黄疸出血群为主，563．89％（23／36）。血清学检测阳性率50．74％（171／337），以黄疸出血群和七日热群为主，分别占50．29％（86／171）和30．41％（52／171）。黑线姬鼠为优势种，占41．48％（475／1145），带菌率为2．95％（14／475），蛙、猪、牛等未检出菌。结论常山县钩体病的主要流行菌群为黄疸出血群和七日热群，主要宿主动物为黑线姬鼠。采用相应的菌苗接种为主导措施，可以有效控制钩体病的流行。     

Protein typing of major outer membrane lipoproteins from Chinese pathogenic Leptospira spp. and characterization of their immunogenicity

Leptospirosis, caused by different Leptospira species, is one of the most widespread zoonotic infections worldwide. Here we expressed three major leptospiral lipoproteins and examined their immunogenicity. All the pathogenic Leptospira strains tested possess the lipL21, lipL32 and lipL41 genes, but the latter two can be further divided into different gene types (lipL32-1, lipL32-2, lipL41-1, lipL41-2). Microscopic agglutination test revealed that rLipLs antisera had extensive cross-immunoagglutination among the 178 leptospiral strains in which rLipL32-1 contributed the highest agglutination titer. The rLipLs-based ELISAs established in this study demonstrated that in the sera of 385 leptospirosis patients infected with different serovars of Leptospira interrogans, rLipL32-1 had the highest positive rates for IgG and IgM (89.4–98.7%), followed by the IgG/IgM positive rates of rLipL21 (87.0–96.1%) and rLipL32-2 (86.5–96.9%), while the two rLipL41s presented the lowest IgG/IgM positive rates (69.9–83.9%). The immunoprotective levels in guinea pigs of rLipL32-1 (58.3% and 66.7%) were the highest, compared to those of the other rLipLs (25.0–58.3%). Multiple different rLipLs would increase immunoprotective levels (from 58.3% and 66.7% to 83.3% and 91.7%). The data suggest that all the rLipLs are the genus-specific superficial antigens of pathogenic Leptospira species and should be considered in designing universal vaccines against leptospirosis.     

Leptospirosis serodiagnosis by ELISA based on recombinant outer membrane protein

The outer membrane protein LipL21, LipL32, LipL41 and Loa22 of Leptospira interrogans serovar Copenhageni were previously revealed by immunoproteomic analysis, using sera from acute phase infection in a guinea pig. The full-length DNA of each protein was then cloned from the same serovar and expressed in pRSET vector. The obtained molecular weight (MW) of recombinant proteins rLipL21, rLipL32 and rLoa22 were slightly higher than the MW predicted from nucleotide sequences of each inserted gene, while only the N-terminal half of rLipL41 was obtained. Mice antiserum raised against each purified recombinant protein could react with the whole cell lysate of leptospiral serovars, implying that leptospiral native proteins shared a common epitope with recombinant protein. Serodiagnosis using recombinant protein antigen based on indirect ELISA procedure was developed in this study. The optimization of the ELISA components lead to determination of optical density (OD) from a single serum-dilution of 1:1000 in the leptospirosis patients group and normal healthy control group. The cut off OD values for both IgG and IgM class were investigated, and based on this fixed dilution only the IgG class could be used for differential diagnosis of patients and normal individuals. Compared with the MAT assay, ELISA assay utilizing both rLipL32 and rLoa22 as antigen, gave high accuracy and could thus be useful as a confirmative serology test.     

江西省钩端螺旋体分离株脉冲场凝胶电泳分型和分析

目的 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,对江西省钩端螺旋体(钩体)患者及动物宿主中分离的钩体菌株型别进行分子流行病学调查.方法 利用核酸内切酶Not Ⅰ对提取的钩体菌株染色体DNA进行酶切,通过PFGE将DNA片段分离.获得的PFGE图像采用分析软件BioNumerics 4.0进行处理并建立数字化数据库,以相似度＞75%为标准,将获各钩体PFGE图谱与中国15群15型钩体参考标准株进行比较并进行聚类分析.结果 江西省不同地区(的139株钩体可分为46个PFGE型,优势型为LepNot Ⅰ.0071、LepNotⅠ.0072和LepNotⅠ.0043型,分别占所有钩体菌株的28.06%、15.11%和7.19%.139株钩体分离株中,84.89%(118/139)菌株的PFGE图谱与6群6型中国钩体参考标准株基本相符,其中32.37%(45/139)钩体菌株属于黄疸出血群赖型,15.83%(22/139)和15.11%(21/139)钩体菌株分别属于澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型.结论 PFGE是一种快速、准确、高效的钩体分型方法 .黄疸出血群赖型是江西省人群及动物中优势血清型,澳洲群澳洲型和爪哇群爪哇型位于其次.     

环介导等温扩增技术在钩端螺旋体病监测中的应用

目的:评价LAMP技术在钩端螺旋体检测与监测中的可行性。方法:采用LAMP技术对感染病人血清及钩体标准菌株感染鼠肾进行检测,同时与卫生行业标准推荐的引物G1/G2 PCR方法进行对比。结果:LAMP快速检测方法 60 min内即可完成检测,具有较高的检测灵敏度,对纯培养的钩体检测灵敏度可达1.5 CFU/ml,比PCR法高出两个数量级,结果肉眼直接可观。同时对21种共42株细菌进行LAMP扩增,仅钩体结果为阳性,显示该LAMP方法具有较强特异性。结论:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,在钩体的快速检测和疫情监控中具有良好的应用前景。     

Infection rate of Leptospira interrogans in the field rodent, Apodemus agrarius, in Korea

Leptospirosis has significantly decreased in Korea since 1988, following the leptospiral vaccination programme initiated in 1988. Whether this wholly explains the decreased incidence is uncertain. As an initial step to answer this question, infection rates of Leptospira interrogans in field rodents, Apodemis agrarius, were examined and compared with previous data. Two hundred and twenty-two A. agrarius were captured during October-December 1996. Spirochaetes were isolated from 22 (9.9%) and leptospiral DNA was detected in an additional 6 rodents (12.6%). Subsequent microscopic agglutination tests (MAT) classified all these isolates as L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar lai. The above data did not significantly differ from previous surveys in 1984-7. There was no significant change of L. interrogans infection in field rodents following the introduction of the vaccination programme in Korea. Further studies are needed to determine the role of human vaccination in reducing incidence.     

安徽省皖南山区钩端螺旋体病流行菌群(型)更迭分析

目的 对安徽省皖南山区钩端螺旋体病(简称钩体病)流行菌群(型)更迭情况进行研究，掌握菌群动态，为甲体病防制提供科学依据。方法 分别采用细菌分离培养和显微凝集试验(MAT)对自然人群、病人、疑似病人及宿主动物进行病原学调查和血清学分析。结果：该地区自然人群及病人血清抗钩端螺旋体标体现以赛罗群棉兰型为主，其阳性率分别为34.13%和25.82%。结论：皖南山区流行菌群（型）与20世纪90年代相比出现更迭现象，从黑线姬鼠肾组织标本中新分离出赛罗群棉兰型钩体菌株，啮齿动物仍是该地区钩体病的主要宿主，水牛是棉兰型钩体病宿主之一。