利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白

目的：筛选呼吸机所致肺损伤（VILI）高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的启动子结合蛋白.方法：制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果：两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论：筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.     

光敏生物素标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段cDNA探针

核酸探针一般多采用同位素标记,限制了它的推广应用。所以应用非放射性标记物代替同位素,具有实际意义。作者采用国产光敏生物素,标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段R_3 cDNA探针,报告如下。1 光敏生物素标记 cDNA探针的敏感性 以R_3克隆cDNA为目的基因,加热变性后再经10倍系列稀释后,点到硝酸纤维素膜上,分别用光敏生物素,生物素-11-dUTP及a-~(32)P-dATP标记的探针杂交检测,结果光敏生物素与生物素-11-dATP敏感性一致,均     

腺相关病毒主要调控蛋白Rep78的表达及其与HBV-X基因启动子的体外结合

目的对腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)Rep78蛋白对乙肝病毒X启动子(HBV-X promoter)的可能作用进行初步研究。方法利用pMAL-Rep78(含有Rep78全长基因的表达质粒)在大肠杆菌中表达并纯化得到带有AAVRep78蛋白的MBP-rep78融合蛋白;通过SDS-电泳及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。合成地高辛标记的X启动子3段探针;以非放射性凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-X启动子的结合。结果得到纯化的MBP-rep78融合蛋白;EMSA结果显示Rep78蛋白在体外能够与HBV-X启动子DNA结合,并有剂量依赖关系。结论AAVRep78可以与HBV-X启动子结合。     

DNA的生物素标记

非放射性标记探针的应用,对于推广基因诊断技术有重要意义。本文研究酶促和光促两法进行生物素标记DNA。以碱性磷酸酶偶联体系检测两法得到的生物素探针及其分子杂交产物,显色灵敏度近1pg,杂交灵敏度达5pg,而5～10×10~5倍的无关DNA没有或痕量非特异性显色。表明此两种生物素标记探针以及所使用的分子杂交和显色体系皆可用于病毒或真核基因的分析和检测。     

完全弗氏佐剂致炎性痛大鼠脊髓背角Fos蛋白的表达

目的:探讨完全弗氏佐剂(CFA)所致炎性痛大鼠Fos蛋白在脊髓背角痛觉传导通路中的表达及意义.方法:64只SD大鼠随机均分为两组,于右后肢踝关节外侧皮下分别注射0.9%生理盐水(NS)或CFA 50 μl,每组取8只观察注射前后热缩足反射潜伏期(TWL)的变化;余48只以免疫组化法检测脊髓背角Fos蛋白表达.结果:大鼠注射CFA后TWL逐渐降低,并在12 h时达最低点(下降62%),持续3 d后缓慢上升,14 d时基本恢复至基础水平;NS组脊髓背角Fos蛋白散在表达,而CFA组中1 h后Fos蛋白最先在大鼠右侧脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层表达(P<0.01),4 h时Ⅴ～Ⅵ层蛋白表达逐渐增多(P<0.01),12 h时脊髓全层蛋白表达最多,至14 d时背角各层少见Fos蛋白.结论:50 μl CFA能诱导大鼠产生为期2周的炎性痛病程.炎症期间脊髓背角Fos蛋白的持续表达与外周痛觉信号的传导和中枢的调控有关.     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止Ｒｎａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

非放射性反义RNA探针的原位杂交技术探讨

以自制的反义ＲＮＡ探针研究了非放射性标记原位杂交技术。结果表明：①以小柱装置（ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ）提取质粒ＤＮＡ，方法快速、简便、且纯度好；②以线性化的质粒ＤＮＡ为模板进行体外转录，加Ｂｉｏ－１４－ＣＴＰ标记，需用ｐＨ８．０的转录缓冲液；③实验中需防止ＲＮａｓｅ污染，但也可应用ＲＮａｓｅ作为实验对照和减低背景；④杂交液中以不加硫酸葡聚糖为宜，杂交温度以４２℃为佳。     

姜黄素对神经病理性痛大鼠脊髓背角c-fos表达的影响

[目的]观察姜黄素对神经病理性痛大鼠痛行为及脊髓背角原癌基因c-fos表达的影响。[方法]采用大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型。雄性SD大鼠108只,随机分为实验对照组、假手术组、溶剂对照组、姜黄素组。采用vonFrey纤维丝和热痛刺激仪测定大鼠热痛缩爪潜伏期(TWL)和机械性缩爪潜伏期(MWT),在术后3、7、14天处死(n=6),用免疫组织化学方法测定c-fos蛋白在脊髓背角神经元的动态变化。[结果]CCI大鼠术侧脊髓背角浅层内Fos阳性神经元明显增多,姜黄素可减轻神经病理痛大鼠的痛行为,也能够明显减少脊髓背角神经元中Fos表达。[结论]姜黄素能减轻神经病理性痛,其机制可能与降低Fos蛋白的合成有关。     

丹参酮IIA磺酸钠对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的影响

目的研究丹参酮IIA磺酸钠（TSIIA）对糖尿病大鼠神经痛的影响及其脊髓氧化应激机制。方法成年雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和丹参酮组,每组6只,佐脲霉菌素（STZ）腹腔注射建立糖尿病模型。采用Von-Frey检测SD大鼠足底机械痛阈值的变化,免疫荧光检测脊髓背角SOD及GFAP免疫阳性物质的表达变化,Real-time PCR检测脊髓背角IL-1βmRNA表达变化。结果与模型组比较,丹参酮组可显著提高机械性痛阈（P<0.05）,提高脊髓背角SOD表达,降低GFAP免疫阳性物质表达（P<0.05）。结论丹参酮IIA减轻糖尿病大鼠神经痛,其机制可能与抑制脊髓神经炎症,上调脊髓背角SOD的表达有关。     

电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

目的: 建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法: 人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果: 人PBMC用抗CD3mAB刺激后15min,明显可见NF-κB活化,30min时达高峰,60min时降低。结论: EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。     

5-HT3受体在慢性神经病理性疼痛模型脊髓组织中的表达

目的观察慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓组织中5-HT,受体的表达变化。方法采用大鼠坐骨神经结扎（慢性压迫性损伤）制备慢性神经病理性疼痛模型。坐骨神经结扎造模后7天,采用测定热缩足反射潜伏期（TWL）和机械缩足反射阀值（MWT）2种行为学方法检测大鼠痛觉闽值变化,免疫组织化学染色法检测大鼠脊髓背角5-HT,受体表达,Westernblot方法检测大鼠脊髓背角中5-HT,受体蛋白水平。结果造模7天后：模型组大鼠的TWL和MWT均低于正常组和假手术组（P〈0．05）,模型组大鼠脊髓背角组织中5-HT,受体表达明显高于正常组和假手术组（P〈0．05）、5-HT,受体蛋白水平高于正常组和假手术组（P〈0．05）。结论在慢性神经病理性疼痛中,脊髓背角组织中5-HT,受体表达增加;脊髓背角组织中5-HT,受体可能参与了慢性神经病理性疼痛的痛觉信息传导过程。     

大鼠坐骨神经损伤后早期脊髓背角小胶质细胞活化状态和活化类型的变化规律

目的 研究坐骨神经损伤后脊髓背角小胶质细胞活化状态和活化类型的变化规律。方法 大鼠随机分为对照组(n=24)、实验组(n=24)。实验组采用结扎坐骨神经主干的方法构建大鼠坐骨神经损伤模型。测量大鼠疼痛行为学数据,于术后第1,7,14天取材,采用免疫荧光染色技术检测大鼠腰段脊髓背角不同激活状态的小胶质细胞变化;通过qRT-PCR验证不同类型小胶质细胞相关标记物的变化趋势。结果 假手术组大鼠在术后14 d内脊髓背角小胶质细胞形态和数量无明显改变,小胶质细胞标记物也无明显变化。术后1 d,CCI大鼠小胶质细胞形态和数量无明显变化,但促炎型(M1型)标记物增加,提示M1型小胶质细胞活化。术后7 d和14 d,CCI大鼠小胶质细胞数量显著增加,标记物检测显示以M1型活化为主,抑炎型(M2型)小胶质细胞活化不明显。结论 大鼠脊髓背角小胶质细胞在坐骨神经损伤后早期即开始活化,活化持续到至少术后两周,在此期间均以M1型小胶质细胞活化为主。     

腹腔注射SRT1720对慢性坐骨神经结扎大鼠痛觉敏化和脊髓Sirt1表达∕活性的影响

目的 观察腹腔注射SRT1720对慢性坐骨神经结扎大鼠痛觉敏化和脊髓Sirt1表达/活性的影响。 方法 将96只SD大鼠随机分为6组:空白对照组(N组)、假手术组(Sham组)、坐骨神经慢性压迫损伤组(CCI组)、CCI+生理盐水注射组(CCI+NS组)、CCI+低剂量SRT1720(SRT1720 20 mg/kg腹腔注射)、CCI+高剂量组(SRT1720 50 mg/kg腹腔注射)。CCI模型建立后,分别通过微量注射器进行腹腔内注射2.5 ml/kg NS、20 mg/kg SRT1720、50 mg/g SRT1720,连续7 d。各组分别在术前和术后第1、3、5、7、10、14天用von Frey细丝测定大鼠的机械性缩足反射阈值(MWT)和热辐射法测定大鼠的热缩足潜伏期(TWL),手术结束后提取大鼠脊髓测定Sirt1蛋白表达和去乙酰化酶活性。 结果 SRT720能抑制大鼠机械性缩足反射阈值和热缩足潜伏期,浓度越高,抑制越明显(P＜0.05);SRT720能增加脊髓背角Sirt1蛋白表达,浓度越高,增加越明显(P＜0.05);SRT720能增加脊髓背角Sirt1去乙酰化酶活性,浓度越高,增加越明显(P＜0.05)。 结论 腹腔注射SRT1720能抑制CCI大鼠的机械痛敏和热痛敏,其作用可能和增加脊髓Sirt1表达/活性有关。      

急性心肌损伤激活脊髓水平白细胞介素1β 信号通路

目的：探讨急性心肌损伤对脊髓水平IL-1β信号通路表达的影响。 方法：采用心肌内注射5%甲醛建立急性心肌损伤模型,于术后1,3,6,24及72 h取颈部脊髓进行研究。Western 印迹检测急性心肌损伤后各个时间段脊髓水平IL-1β的蛋白表达量。免疫组织化学和原位杂交检测IL-1β的细胞定位。电泳迁移率（EMSA）试验检测急性心肌损伤对IL-1β的下游转录因子NF-κB 和 AP-1活性的影响。结果：急性心肌损伤后,脊髓水平的IL-1β的表达显著增高并且持续至心肌损伤后72 h;上调的IL-1β的蛋白和mRNA主要在脊髓灰质II~IV层神经元中表达;急性心肌损伤后,NF-κB和AP-1的DNA结合率显著增强。 结论：急性心肌损伤导致脊髓水平IL-1β信号通路的激活,激活的中枢神经系统的细胞因子通路有可能进一步加重心肌损伤。     

抑制脊髓络丝蛋白表达对神经性疼痛成年大鼠疼痛行为的影响研究

背景　络丝蛋白是主要参与神经元发育和成熟大脑突触过程的大分子细胞外基质糖蛋白。在神经元迁移过程终止后,脊髓尤其是脊髓背角浅层的神经元中仍有络丝蛋白的表达。神经性疼痛大鼠脊髓背角中络丝蛋白的表达明显减少,但其在伤害性感受和疼痛中的作用仍不明确。目的　探讨鞘内注射络丝蛋白shRNA对成年大鼠疼痛行为的影响。方法　2015年,选取8~10周龄的SPF级雄性SD大鼠119只,置管成功108只,采用随机分组法将其分为正常（Norm）组12只、RNA干扰（RNAi）组12只、假手术（Sham）组12只、Sham+RNAi（SR）组6只、慢性坐骨神经压迫性损伤（CCI）组27只、CCI+RNAi（CR）组27只、CCI+空载体（EV）组12只。CCI组、CR组和EV组制备CCI模型,RNAi组、SR组、CR组鞘内给予络丝蛋白shRNA慢病毒载体,EV组给予空载体。计算干预后第4、7、10、14、21天络丝蛋白表达水平,于干预后第10天进行免疫组织化学观察络丝蛋白定位情况,检测干预前及干预后第1、4、7、10、14、17、21天大鼠足底机械缩足阈值（PWMT）、热辐射刺激潜伏期（PWTL）。结果　RNAi组第10天左、右侧络丝蛋白表达水平均高于Norm组,CR组第10天左侧络丝蛋白表达水平低于Sham组、CCI组,CCI组、CR组、EV组第10天右侧络丝蛋白表达水平均低于Sham组,CR组第10天右侧络丝蛋白表达水平低于CCI组,CCI组第4天右侧络丝蛋白表达水平低于CCI组左侧,CR组第4天右侧络丝蛋白表达水平低于CR组左侧,CCI组右侧、CR组左侧第7、10、14、21天络丝蛋白表达水平均低于CCI组左侧,CR组右侧第7、10、14、21天络丝蛋白表达水平均低于CCI组右侧（P<0.05）。Norm组络丝蛋白弥漫性分布于脊髓背角Ⅰ~Ⅱ、Ⅴ板层和外侧脊髓核（LSN）;RNAi组双侧脊髓背角的Ⅰ~Ⅱ板层及LSN中仅有极少量络丝蛋白,Ⅴ板层仍存少量表达;Sham组双侧脊髓背角中络丝蛋白表达则无明显影响;CCI组右侧脊髓背角中络丝蛋白表达水平低于对侧;CR组双侧脊髓背角浅层仅有少量络丝蛋白表达;空载体对EV组络丝蛋白的表达无明显影响。第1、4、7、10、14、17、21天CCI组、CR组、EV组的PWMT、PWTL均低于Sham组,第7、10、14、17、21天CR组的PWMT、PWTL均低于CCI组（P<0.05）。结论　在生理状态下,脊髓背角络丝蛋白对痛觉阈值无明显作用,但脊髓背角络丝蛋白表达减少可能参与神经损伤引起的神经性疼痛的发展过程。     

骨形态发生蛋白及其受体在正常成年大鼠脊髓中的表达分布

目的:观察骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)及其受体在正常成年大鼠脊髓中的表达分布.方法::取正常成年大鼠脊髓并切片,运用免疫组织化学方法分别检测BMP2,4,7及其受体BMPR Ⅰa,BMPR Ⅰb,BMP Ⅱ的表达.结果:在正常成年大鼠脊髓的前角运动神经元、背角感觉神...     

醋酸泼尼松龙鞘内注入对脊髓P物质的影响

目的　探讨泼尼松龙鞘内注入镇痛的脊髓机制。方法　慢性鞘内置管的SD大鼠随机分为泼尼松龙组和对照组 ,每组 6只。泼尼松龙组大鼠鞘内注入泼尼松龙 2mg kg(2 0 μl) ,对照组注入等容积生理盐水 ,1h后进行福尔马林试验 ,动物继续存活 2h后取脊髓腰段 (腰膨大 )多聚甲醛固定的冰冻切片。P物质免疫组化显示用ABC法。结果　两组大鼠右侧脊髓背角浅层P物质光密度值较左侧明显增加 ,泼尼松龙组大鼠脊髓背角浅层P物质含量较对照组无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,P物质免疫反应产物无明显变化。结论　泼尼松龙鞘内注入对脊髓背角浅层P物质无显著影响     

神经元性一氧化氮合酶在强啡肽致瘫和镇痛中的作用

目的 探讨神经元性原生型一氧化氮合酶（ｎｃＮＯＳ）在强啡肽（Ｄｙｎ）Ａ（１－７）致瘫和镇痛中的不同作用。方法 采用ｎｃＮＯＳ免疫组织化学和＾３Ｈ－左旋精氨酸转化技术,观测Ｄｙｎ致瘫和镇痛过程中ｎｃＮｏＳ活性和免疫活性（ＩＲ）变化,并探讨ｎｃＮＯＳ选择性抑制剂７－硝基吲唑对Ｄｙｎ致瘫和镇痛作用的影响。结果 ＤｙｎＡ（１－１７）蛛网膜下腔注射引起的剂量相关性后肢和尾部瘫痪及甩尾甩足抑制;ＤｙｎＡ（１－     

大鼠脊髓背角内第5型代谢型谷氨酸受体免疫组织化学特征

应用免疫组织化学方法在光镜下观察到,大鼠脊髓内第5型代谢型谷氨酸受体(mGluR5)主要分布在背角Ⅰ～Ⅲ层内;行单侧背根（L1～L6）切断术后,未见术侧mGluR5免疫反应性明显变化;脊神经节内仅见极少数神经元呈mGluR5免疫反应弱阳性。由此提示,脊髓背角内mGluR5的主要来源为非一级传入神经元。免疫电镜研究显示,在脊髓背角浅层内,mGluR5主要定位在部分神经元胞体和大量树突内,并常见部分含mGluR5的树突与具有一级传入C纤维终末形态特征的轴突终末构成突触小球。mGluR5在脊髓背角浅层内的超微定位特征表明,脊髓背角内的mGluR5可能主要作为突触后受体介导或调节谷氨酸传递一级感觉(包括痛觉)的功能。     

刺激脊髓背根对相邻脊髓背角乙酰胆碱和钙离子的影响

以切断一对背根并横断相邻脊髓为动物模型,用离子选择电极测定刺激一侧离断背根后,观察相邻脊髓后角ACh及Ca2＋活度的变化。结果发现：①刺激侧的相邻脊髓后角浅层ACh活度明显升高,与刺激前相比有显著性差异（P＜0．05）,对照侧略有上升,但无统计学意义;②刺激侧的相邻后角浅层细胞外Ca2＋活度明显降低,与刺激前相比有显著性差异;对照侧无明显变化。表明：刺激一侧离断背根可引起同侧相邻离断脊髓后用内细胞外Ca2＋活度降低及ACh活度升高,证明离断背根与相邻脊髓后角间存在着跨节段信息传递,这种传递是通过体感神经外周末梢间某种联系实现的。