载脂蛋白M基因启动子克隆及功能初步研究

目的克隆apoM基因的上游启动子序列,构建启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因,并观察其不同截短片段的启动子活性,为进一步研究apoM基因的表达调控机制奠定基础。方法在对apoM基因生物信息分析的基础上,采用5’RACE确定了apoM基因的转录起始点,构建了6种不同长度apoM基因启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic(A-F),将它们瞬时转染HepG2细胞,并检测其荧光素酶活性。结果 pGL3-Basic-C的荧光素酶活性最高。结论 -401～-621bp可能是apoM的核心启动子区。     

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过PCR方法从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5′上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果经PCR方法扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础。     

FSHB启动子基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

目的 克隆人卵泡刺激素β亚基(Follicle Stimulating Hormone β-subunit,FSHB)的启动子;构建FSHB启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法 设计合成FSHB启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增FSHB启动子序列;将扩增片段插入载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至PGL6-TA荧光报告基因载体;瞬时转染进Hela细胞,收集细胞裂解液后,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果 PCR扩增得到人FSHB基因启动子;成功构建pGL6-FSHB-promoter报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.通过荧光素酶相对表达效率比较,在Hela细胞的体外实验中发现,FSHB-211G→T突变后荧光素酶表达具有更高的效率,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建人FSHB基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究FSHB转录表达的调控机制提供基础.     

小鼠核结合因子a1基因启动子报告载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠核结合因子a1(Cbfa1)基因启动子萤光素酶报告载体,并检测其驱动报告基因的转录活性。方法:以小鼠基因组DNA为模板,巢式PCR扩增含有Cbfa1基因启动子(-1000～+200bp)的序列。限制性内切酶MluI和XhoI酶切这段序列后定向克隆到不含启动子的PGL3-Basic报告基因载体上,重组质粒命名为pGL3-Cbfa1。pGL3-Cbfa1瞬时转染成骨细胞系MC3T3-E1,检测其能否在Cbfa1基因启动子的调控下表达报告基因并提高萤光素酶活性。结果:pGL3-Cbfa1经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明Cbfa1启动子具有转录活性,pGL3-Cbfa1的萤光素酶水平约是pGL3-Basic的35倍。结论:小鼠Cbfa1启动子报告基因载体的成功构建,为进一步将其用于抗骨质疏松药物的筛选与评价奠定了实验基础。     

人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测

目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒。用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达。同时,将上述MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2 A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达。结果重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白;pGL3-MANF-5F重组质粒在N2 A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论已成功克隆了MANF基因的5'端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础。     

ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的鉴定

目的构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞。荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位。生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果成功构建含有新启动子的重组质粒。与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363bp至-63bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点。结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363bp至-63bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控。     

Identification of the new promoter in the fisrt intron of ORMDL3 gene

目的 构建表达血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因第一内含子中新启动子区的质粒,并研究其功能特征.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增ORMDL3基因第一内含子内新转录起始位点上下游776 bp启动子区片段,酶切并连接此片段至pGL3-basic载体,构建含有ORMDL3基因第一内含子中新启动子区的基因重组体,并转染人胚肾293细胞.荧光素酶检测报告基因启动子的活性,计算相对活性单位.生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果 成功构建含有新启动子的重组质粒.与pGL3-basic空载体相比,新启动子活性明显增强,并定位于转录起始位点-363 bp至-63 bp之间,且该区域存在Sp1、GATA-1等转录因子的结合位点.结论 ORMDL3基因第一内含子中新转录起始位点上游具有启动子活性,在-363 bp至-63 bp区域存在转录调控元件,且Sp1、GATA-1等转录因子可能参与其转录调控.     

人破骨细胞分化因子基因启动子报告载体的构建

目的：构建能够报告人破骨细胞分化因子（ODF）基因启动子活性的表达载体。方法：以人基因组DNA为模板，PCR扩增含有ODF基因启动子的2段序列（-2433-1243 bp和-1262-＋100bp）。通过T-A克隆将这2个序列片段分别连接到pGEM-TEasy克隆载体上。利用特定的限制性内切酶位点。将这2个序列片段酶切后进行正确拼接并定向克隆到不含启动子的pEGFP-1报告基因载体上。将该重组质粒pEGFP-1-ODF瞬时转染成骨细胞系UMR106．检测其能否在ODF基因启动子（-2358-＋100bp）的调控下表达报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。结果：pEGFP-1-ODF经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明，pEGFP-1-ODF转染的UMR106能表达EGFP。结论：人ODF基因启动子报告载体的成功构建。为进一步研究ODF基因表达转录水平的调控机制奠定了基础。     

中国恒河猴指名亚种基因中BamHⅠ重复序列的克隆与结构分析

探索灵长类细胞基因中重复序列结构与基因启动调控序列的关系,获得具有启动子功能的基因结构。方法：使用酶切－ＰＣＲ技术,从中国恒河猴指名亚种基因中,克隆ＢａｍＨⅠ基因重复序列,并对其结构进行序列测定、分析和ＤＮＡ结合实验。结果：克隆到两个ＢａｍＨⅠ基因重复序列片段。结论：提示这两个重复序列片段 中具有启动调控的典型结构,因而具备用于构建真核表达载体的可能性。     

MIBP1基因敲除载体的构建

目的:构建MIBP1基因敲除载体。方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为模板,根据GenBank注册序列,扩增小鼠MBP-2基因启动子区5′端片段(5′arm)和内含子区3′端片段(3′arm),然后分别克隆进敲除载体pKOScramblerNTKV-1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV-3′,5′arm。用SalⅠ对pNTKV-3′,5′arm线性化,用于胚胎干细胞电转染。结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP-2基因的5′arm和3′arm片段,构建了MIBP1基因敲除载体。结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体。     

双环醇对组成型雄甾烷受体和孕烷X受体介导的CYP3A4和CYP286转录的调控

目的：构建pGL4．17-CYP3A4启动子嵌合报告基因表达载体,研究双环醇是否通过活化组成型雄甾烷受体（Constitutive Androstane Receptor,CAR）和孕烷X受体（pregnane Xreceptor．PXR）影响CYP3A4及CYP286的转录。方法：以提取的人肝组织基因组DNA为模板,应用RT-PCR技术,扩增获得CYP3A4启动子的近端启动序列（-362／＋53）和远端调控序列（-7836／-7208）,并连接到pGEM-T载体,测序正确后将目的基因片段先后插入至pGL4．17报告基因表达载体。将hPXR、hCAR表达载体分别与CYP3A4及CYP286报告载体共转染HepG2细胞,利用双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4及CYP286均具有启动活性后,双环醇分别与转染hPXR和CYP3A4、hCAR和CYP3A4、hCAR和CYP286的HepG2细胞温孵24h后,收获细胞并裂解,检测活性以分析双环醇对CYP3A4及CYP286的转录调节途径。结果：获得pGL4．17-CYP3A4启动子嵌合报告基因表达载体,经酶切鉴定及核酸序列测定证实该报告基因表达载体构建成功。双环醇主要通过活化CAR受体途径,调控CYP3A4和CYP286的转录,而PXR受体途径较少参与。     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

麻疹H基因克隆及表达条件优化

目的克隆麻疹H蛋白基因,构建重组表达质粒,诱导表达蛋白。方法麻疹Edmonston株减毒活疫苗中提取基因组RNA,RT-PCR扩增H基因。用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切H蛋白基因片段和pET30a(+)载体,连接后获得重组质粒MV-H-pET30a(+),转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果 RT-PCR扩增片段长度约为1900bp,与MV-H基因相符。MV-H-pET30a(+)测序结果显示:MV-H基因对码正确,核苷酸序列符合率达99.7%。SDS-PAGE结果表明,菌体中含有特异性蛋白,大小约为86kD。结论在pET30a(+)成功克隆麻疹H基因,并有目的蛋白表达。     

忍冬U6启动子的克隆及功能验证

以忍冬基因组DNA为模板,克隆并筛选出具有较高转录活性的忍冬U6启动子。采用PCR方法,从忍冬基因组中克隆到4个LjU6启动子,长度分别为336、708、359、602 bp, PlantCARE分析发现4个启动子中均含有TATA框以及CAAT框等典型的启动子顺式元件,且包含与光响应、胁迫响应等相关的调控元件;克隆产物经测序正确后,将LjU6启动子连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pBI121载体,成功构建4个LjU6-pBI121融合表达载体,通过农杆菌瞬时转化法转化烟草叶片,并对叶片进行GUS组织化学染色,染色结果显示LjU61-F1转录活性最高,本研究初步筛选出转录活性较高的忍冬U6启动子,为忍冬CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立奠定了基础。     

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性.方法 提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒pGL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染HeLa细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性.结果 质粒pGL3-h1(-6--463,457bp),pGL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与 β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌HeLa细胞.转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果 显示pGL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而pGL3-h1为67936,pGL3-h2为64234.19.空质粒与pGL3-h1,pGL3-h2之间差异具有统计学意义,而pGL3-h1,pGL3-h2之间差异不具有统计学意义.结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性.     

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。     

survivin基因启动子在多种肿瘤细胞株中的转录活性研究

目的:研究两个长度不同的survivin基因启动子在多种肿瘤细胞株中的活性。方法:利用脂质体将不同长度的sur-vivin基因启动子调控荧光素酶的报告基因载体瞬时转染HepG2、Lovo、SW480、AGS肿瘤细胞和3T3正常细胞,48 h后经荧光素酶检测,比较两个survivin基因启动子的活性。结果:两个不同长度的survivin基因近端启动子在多种肿瘤细胞株中均显示出较高的活性,其中以pGL3-Surp340的活性最高。结论:实验中使用的两个survivin启动子片段肿瘤细胞中有转录活性,在3T3正常细胞中活性低。其中survivin340启动子的活性明显高于survivin1430启动子,其有可能作为调控元件用于肿瘤的靶向性基因治疗。     

利用反义RNA技术抑制酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达

羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径。有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5’长片段(包括erg7基因5’非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5’短片段(包括erg7基因5’非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体p ESC-URA上,构建反义表达质粒。用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株。通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVSc1相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5’长反义片段和5’短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5’短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5’长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低。本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础。     

小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物，通过RT-PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针，用噬斑原位杂交法克隆129品系小鼠的bcl10基因组DNA，在亚克隆完成序列结构分析的基础上，利用常规分子克隆技术，构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游2.4kb和exon4下游4.5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体，为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。