银杏叶多糖在肿瘤放射、化学治疗中的增敏作用研究

目的：探索银杏叶多糖对鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞放射和化学治疗敏感性的影响。方法：采用MTT比色法和台盼蓝拒染法,观察鼻咽癌细胞CNE-2、宫颈癌Hela细胞株经过药物作用后其放射敏感性的变化以及银杏叶多糖与多种抗癌药物合用后对鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的生长抑制的作用。结果：银杏叶多糖与CNE-2细胞、Hela细胞混合培养后进行照射,其作用效果与药物浓度存在良好的相关性。同时银杏叶多糖与环磷酰胺、卡铂、顺铂、5-Fu、盐酸阿霉素等药物合用,其抑制鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的生长能力强于各药物单独使用的抑制率。结论：银杏叶多糖可增加化疗药物对鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的治疗敏感性。是一种有希望的放射增敏剂。     

MTT法检测口腔恶性肿瘤细胞化疗药物的敏感性

目的　运用MTT 法测定口腔鳞癌细胞体外对化疗药物的敏感性及其适用价值。方法　选用不同剂量的8种抗癌药物与18例口腔及口咽鳞状细胞癌标本孵育不同时间后,噻唑兰(MTT) 法测定离体癌细胞对8种化疗药物的体外敏感性。结果　18例口腔及口咽鳞癌细胞对化疗药物均呈不同的敏感性,但不同个体对各种化疗药物的敏感性之间存在差异。结论　以MTT法检测口腔鳞癌细胞对化疗的敏感性有助于指导临床选择肿瘤敏感的化疗药物,避免盲目选用肿瘤非敏感性化疗药对机体造成的不良反应     

两种不同分化程度的鼻咽癌细胞在化疗药物作用前后多药耐药基因的表达

目的 检测鼻咽癌CNE1和CNE2细胞在阿霉素(adriamycin,ADM)作用前后多药耐药基因(mdr1 基因)及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表达及功能变化.方法 利用RT-PCR,Western blotting和流式细胞仪(FCM)检测CNE1和CNE2细胞在阿霉素作用前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素(daunorubicin,DNR)的外排功能.结果 鼻咽癌CNE1和CNE2细胞在阿霉素作用前mdr1基因、P-gp不表达;阿霉素作用后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达,对柔红霉素的蓄积较阿霉素作用前低.结论 化疗可能诱导鼻咽癌细胞的多药耐药.     

白藜芦醇对缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2的化疗增敏作用

目的：观察缺氧环境下白藜芦醇（resveratrol,Res）提高人鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物敏感性的作用并探讨其机制。 方法：将不同浓度白藜芦醇加入化疗药物干预过的CNE2中,低氧培养48 h,甲基噻唑基四唑法检测CNE2中白藜芦醇对化疗药物的逆转倍数,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,应用反转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹法检测CNE2细胞中多药耐药相关基因1（multidrug resistance gene 1,mdr1）、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1,MRP1）和缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）mRNA和蛋白水平的表达变化。 结果：缺氧环境下白藜芦醇对化疗药物具有协同增效作用,200 μmol/L白藜芦醇对紫杉醇的逆转倍数为2.58。25、50、100和200 μmol/L白藜芦醇与紫杉醇合用,使紫杉醇诱导的CNE2细胞凋亡增加,且表现出明显的浓度依赖效应。此外随着白藜芦醇浓度的增加,mdr1、MRP1和HIF-1α的表达显著降低,加用白藜芦醇组与不加白藜芦醇组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论：白藜芦醇可以通过下调核转录因子HIF-1α及多药耐药相关基因mdr1、MRP1的表达提高缺氧环境中鼻咽癌细胞株CNE2对化疗药物的敏感性。     

小剂量顺铂连续化疗对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性影响的体外研究

目的以小剂量顺铂连续化疗模拟节律化疗方式,采用细胞培养方法研究此种给药方式对鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE-1细胞放射敏感性的影响,为临床鼻咽癌同步放化疗探索一种新的高效低毒的治疗模式。方法 MTT方法检测顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞的半抑制浓度(IC50),1/5IC50为小剂量化疗参考剂量,而IC70则为MTD化疗参考剂量。细胞分4组进行如下处理:A组剂量为1/5IC50的顺铂连续作用96h后进行放疗;B组剂量为IC70的顺铂连续作用3h后立即给予放疗;C组为IC70作用3h后间隔93 h进行放疗;D组为未加入顺铂化疗的鼻咽癌细胞株同样条件下培养96h后进行放疗。克隆形成实验计算细胞存活率,采用单击多靶模型绘制剂量存活曲线,比较各处理组辐射敏感性变化。结果顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞株作用72h的IC50值为0.26μg/ml,1/5IC50为0.05μg/ml,IC70为0.72μg/ml。采用单击多靶模型计算各处理组的SF2值与SER值如下:A组SF2为(0.414±0.008),SER值为(1.429±0.110);B组SF2值为(0.502±0.010),SER值为(1.012±0.129);C组SF2值为(0.411±0.014),SER值为(1.400±0.169);D组SF2为(0.603±0.100)。结论采用类似节律化疗方式给药,与放疗联用可以引起CNE-1细胞株放射敏感性增高。     

MTT法测定食管癌对化疗药物敏感性的实验研究

目的探讨肿瘤药敏试验在食管癌化疗选药中的作用。方法将43例患者的食管癌组织进行体外培养,以临床常用的7种化疗药物加以干预,MTT法检测化疗药物对癌细胞的抑制率。结果食管癌对丝裂霉素、氟尿嘧啶、多西他赛、泽菲、环磷酰胺、健择、顺铂中度敏感,7种化疗药物对食管癌细胞的抑制率无显著性差异（P=0．69）。对食管低分化鳞癌细胞的抑制率显著高于高分化者（P=0．025）,DDP对食管中分化鳞癌细胞的抑制率显著高于高分化者（P=0．017）。食管上段、中段、下段癌细胞对以上7种化疗药物的敏感性无显著性差异（P〉0．05）。结论DDP、对食管癌细胞分化程度低者抑制作用较强。初次化疗的食管癌患者对多种化疗药物均较为敏感,但各药的抑制率无显著性差异,故可先使用价格便宜的普通药物,当病情出现反复时再更换化疗方案,以避免耐药,从而提高疗效,并节省费用。     

薏芯仁酯对辐射诱导的人鼻咽癌细胞凋亡的促进作用

目的：探讨薏苡仁酯（coixenolide,CXL)对辐射诱导的人鼻咽癌细胞（CNE－2Z凋亡的影响。方法：以60Co为放射源,采用形态学（荧光染色）方法和流式细胞术观察CNE－2Z细胞的凋亡和药物作用,结果：CNE－2Z经照射后,凋亡细胞数增加,并与放射剂量和观察时间成正相关。加入CXL,可使放射量效曲线和时效曲线左移,流式细胞仪分析也得到相似的结果。辐射也诱导正常细胞凋亡,但CXL并没有加强此作用,结论：CXL能选择性地促进射线所致的细胞凋亡。     

艾恒与传统化疗药物在不同分化程度胃癌细胞株中敏感性的研究

目的:探讨不同分化程度胃癌细胞对艾恒、5-FU、MMC和VP-16的敏感性。方法:将不同浓度的化疗药物与两株不同分化程度的胃癌细胞株共同温育,采用MTT方法检测化疗各药物对胃癌细胞增殖的影响。结果:四种化疗药物对两株胃癌细胞的增殖均具有显著的抑制作用,MKN45细胞株对各化疗药物敏感性顺序为:MMC>VP-16>艾恒>5-FU,而SGC7901细胞株对各化疗药物敏感性顺序为:MMC>艾恒>VP-16>5-FU。中分化的SGC7901对艾恒、MMC、VP-16的敏感性均显著高于低分化的MKN45,而MKN45对5-FU的敏感性高于SGC7901。结论:不同分化程度的胃癌细胞对药物的敏感性不同。     

PI3K/Akt抑制剂对肺癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的 探讨PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002与化疗药物联合使用对肺癌细胞A549、SPC-A1化疗效果的影响.方法 将LY294002联合化疗药物作用于肺癌细胞A549、SPC-A1,用MTT法检测单独使用顺铂、紫杉醇及联合PI3K抑制剂LY294002对体外培养的肺癌细胞A549、SPC-A1对化疗药物的敏感性,用流式细胞术检测肺癌细胞A549、SPC-A1凋亡率和细胞周期变化.结果 联合LY294002作用后肺癌细胞A549、SPC-A1对化疗药物顺铂、紫杉醇敏感性显著增强(P<0.01),且细胞凋亡率显著提高(P<0.01),G0/G1期细胞比例增加,S+G2/M期细胞比例减少(P<0.05).结论 LY294002能有效提高化疗药物顺铂、紫杉醇体外对A549、SPC-A1细胞抑制作用的敏感性,抑制PI3K介导的信号转导通路,显著提高肺癌化疗效果.     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的分析5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2dC）对鼻咽癌细胞株CNEl、CNE2、5-8F、6-10B增殖、凋亡和细胞周期分布的影响。方法用不同浓度5-aza-2dC处理鼻咽癌细胞，MTT实验观察细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况和凋亡细胞比例。结果5-aza-2dC对4株细胞的增殖均具有抑制作用，CNEl和6-10B细胞的半数抑制剂量低于CNE2和5-8F。药物处理使4株细胞凋亡率呈剂量依赖性增加，CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。经5-aza-2dC处理后，CNEl、CNE2、6-10B细胞出现不同程度G0／G1期阻滞，而5-8F表现为G0／G1期和G2／M期双期阻滞．CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。结论5-aza-2dC对CNEl、CNE2、5-8F和6-10B细胞具有抑制增殖、促进凋亡和细胞周期阻滞作用，CNEl和6-10B对药物敏感性高于CNE2和5-8F。     

人鼻咽癌多药耐药细胞株CNE2/ADM的建立及生物学特性研究?

目的：建立人鼻咽癌多药耐药细胞株 CNE2/ADM,并研究其生物学特性。方法以人鼻咽癌细胞株 CNE2为亲本细胞,采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法诱导建立多药耐药细胞株 CNE2/ADM。通过观察细胞形态学变化,药物敏感性试验,测定生长曲线、群体倍增时间、细胞周期及 P-糖蛋白(P-gp)功能和表达情况,评价CNE2/ADM 的生物学特性。结果与 CNE2细胞相比,CNE2/ADM 耐药细胞异形明显,并对 ADM 在内的4种化疗药物产生了耐药性,增殖速度减慢,群体倍增时间延长(P <0.05),G0/G1期细胞增多,S 期、G2/M 期细胞减少(P <0.05),P-gp 的药物泵出功能增强、表达水平升高。结论成功建立了人鼻咽癌多药耐药细胞株 CNE2/ADM,其具有典型的多药耐药表型,可作为进一步研究鼻咽癌多药耐药机制及筛选逆转剂较为理想的细胞模型。     

结合黏附分子家族A表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系研究

目的 研究结合黏附分子家族A(JAMA)表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系.方法 过表达或干扰CNE2和HONE1细胞株中JAMA的表达,然后采用不同剂量X射线进行照射,24 h后检测细胞克隆形成能力及细胞凋亡变化,了解JAMA在鼻咽癌放疗中的作用.通过Western blot检测JAMA不同表达水平细胞株放疗后的相关信号通路蛋白.结果 JAMA低表达细胞株对放疗更敏感:JAMA低表达后,D0值在CNE2细胞株中从3.26±0.78下降为1.92±0.23;Dq值从46.51±4.27下降至32.12±3.19.放疗诱导的凋亡在JAMA低表达细胞株中显著增加,JAMA低表达后,细胞凋亡率从6.9％±0.9％上升至13.7％±1.3％;HONE1细胞凋亡率从6.5％±1.1％上升至12.3％±1.7％;JAMA过表达细胞株中显著减少.结论 JAMA表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性密切相关,JAMA能增加鼻咽癌细胞株放疗抵抗.     

X射线照射后鼻咽癌细胞多药耐药基因的表达

目的 通过检测射线照射前后鼻咽癌CNE1细胞多药耐药基因(mdr1基因)及其编码产物P糖蛋白(P-gp)的表达和功能为临床鼻咽癌放化疗顺序提供参考。方法 利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪检测射线照射前后CNE1细胞的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素的外排功能。结果 鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达;照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达;对柔红霉素的摄取较射线照射前低。结论 鼻咽癌CNE1细胞射线照射后化疗敏感性降低,提示临床对于中晚期鼻咽癌的治疗应考虑先化疗再放疗即诱导化疗的治疗方案。     

X射线照射后鼻咽癌细胞多药耐药基因的表达

目的 通过检测射线照射前后鼻咽癌CNE1细胞多药耐药基因(mdr1基因)及其编码产物P糖蛋白(P-gp)的表达和功能为临床鼻咽癌放化疗顺序提供参考。方法 利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪检测射线照射前后CNE1细胞的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素的外排功能。结果 鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达；对柔红霉素的摄取较射线照射前低。结论 鼻咽癌CNE1细胞射线照射后化疗敏感性降低，提示临床对于中晚期鼻咽癌的治疗应考虑先化疗再放疗即诱导化疗的治疗方案。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

SETD2基因敲除前后鼻咽癌细胞中定量蛋白组学研究及差异信号富集

目的分析甲基转移酶SETD2 表达改变对人鼻咽癌（NPC）细胞中蛋白表达谱的影响并富集差异信号通路。方法提取 SETD2基因敲除细胞株CNE1SETD2-KO和野生型细胞CNE1WT的总蛋白,利用Tandem Mass Tag（TMT）标记蛋白质定量技术和串联 质谱分析技术筛选出差异表达蛋白质,应用GO数据库对差异表达蛋白质进行注释和富集,应用KEGG数据库进行差异蛋白质 涉及信号通路富集。结果以表达倍数（FC）≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,SETD2基因敲除的CNE1细胞鉴别出2049个差异表 达蛋白质,其中904个表达上调,1145个表达下调。GO功能注释结果表明,SETD2敲除后在生物过程（细胞过程及调节,细胞运 动、代谢过程及细胞组分的生物合成）、分子功能（催化活性及分子结合、转录因子活性）和细胞组分（胞膜、细胞器、大分子复合 物）等具有特征性。KEGG信号富集结果表明SETD2 敲除主要影响与肿瘤关系密切的信号有MAPK、PI3K-Akt、Ras、Rap1、 mTOR、Hippo、HIF-1、Wnt、AMPK、FoxO、ErbB、p53、JAK-STAT等。结论SETD2敲除后显著改变了NPC细胞中蛋白质表达特 征并影响多条与肿瘤关系密切的信号通路,研究结果为NPC的发病机制和治疗标靶筛选提供了参考。     

可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异。结论建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础。     

3号染色体短臂21-22区域63个新基因在鼻咽癌组织中的差异表达

目的 寻找与鼻咽癌发病密切相关的未知基因。方法 对63个定位于3号染色体短臂21-22D3S1609-D3S1295区域的单拷贝并代表未知基因的EST簇进行网上克隆,在获取基因大片段或全长cDNA序列的基础上,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测63个未知基因在4种鼻咽癌细胞株、32例鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织和16例鼻咽部慢性炎症组织中的表达状况。结果 49个未知基因在鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织间的表达水平无显著性差异;8个未知基因在鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中均不表达;2个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显增强;4个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显减弱,其中Hs.27566基因在鼻咽癌细胞和组织中均显著低表达或不表达。结论 在染色体3p21-22D3S1609-D3S1295区域构建了63个未知基因在鼻咽癌的表达差异谱;筛选出6个在鼻咽癌组织中差异表达的未知基因。     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX,RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞,G418筛选后,观察和检测转基因细胞的形态学特点,在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化;用pLNSX,pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞,检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比,CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态,相对迁移明显增大（n=3,P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失;随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2,0、6,1．0μg）,对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加,呈明显浓度依赖性;LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型,对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一,位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

干扰长链编码RNA FOXCUT能抑制鼻咽癌细胞上皮间质转化及诱导线粒体损伤

目的 探讨干扰长链编码RNA FOXCUT对鼻咽癌细胞上皮间质转化及线粒体功能的影响。方法 RT-PCR检测50例鼻咽癌患者癌组织及癌旁组织和NP69、CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞株中FOXCUT表达水平;将shRNA FOXCUT转染至CNE1细胞,随机分组为Control组、shRNA-NC组和FOXCUT-shRNA3组。采用CCK8法和克隆形成实验检测细胞增殖;显微镜观察细胞形态;免疫荧光检测Vimentin+含量;试剂盒检测氧化应激标记物SOD、MDA、LDH的水平;流式检测线粒体膜电位的变化;Western blot法检测E-cad、N-cad、Vimentin、Bax、Bcl-2、caspase-3和c-Myc蛋白表达水平。结果 与癌旁组织相比,鼻咽癌组织中FOXCUT表达水平均升高（P<0.001）。与NP69细胞相比,CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞FOXCUT表达水平均升高（P<0.001）。与Control组相比较,FOXCUT-shRNA3组细胞增殖倍数及克隆形成率降低（P<0.001）,细胞形态呈短梭形、扁平型或圆形,细胞间的连接较为紧密,具有铺路石样特征;N-cad、Vimentin的表达水平降低,E-cad的表达水平升高（P<0.05）,Vimentin+含量降低（P<0.001）,MDA、LDH的含量明显升高（P<0.05）,SOD的活性明显降低（P<0.05）,红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显,绿色荧光细胞百分比增加,Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3表达显著上升,c-Myc表达显著降低（P<0.001）。结论 干扰长链非编码RNA FOXCUT能够抑制鼻咽癌细胞增殖,减少上皮间质转化,增强氧化应激、降低膜电位,诱导CNE1细胞线粒体功能损伤,促进凋亡;干扰长链非编码RNA FOXCUT对CNE1细胞抑制效果显著,具有靶向治疗鼻咽癌的潜力。