猪角膜脱细胞基质的制备及生物相容性的实验研究

目的探讨猪角膜脱细胞基质（CACM）的制备方法，评价其组织学特性和生物相容性。方法应用1％TritonX-100去垢剂振洗，经冷冻干燥处理得到猪CACM，通过苏木精-伊红染色、扫描电镜观察行组织学检测。将猪CACM植入兔角膜板层间观察10周，取材做组织切片，评价其生物组织相容性。结果组织学检测证实角膜细胞完全脱净，胶原纤维排列疏松，板层结构同正常角膜；扫描电镜CACM表面未见细胞结构，纵切面上胶原板层间出现清晰的空穴状裂隙；CACM植入兔角膜层间后，观察期内未见明显排异反应。结论TdtonX．100可以有效地脱净角膜细胞，保存胶原排列的结构特征，经过冷冻干燥可形成多孔隙且胶原排列疏松的板层结构，适合作为载体材料，猪CACM与兔角膜生物相容性好。     

异种角膜脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较

目的探索异种角膜脱细胞基质和几丁糖为载体构建生物角膜组织的可行性，评价二者的结构、功能和生物相容性。方法l％TritonX-100及冷冻干燥处理获得猪角膜脱细胞基质，网状几丁糖材料制备成似角膜片状形态，将体外培养的兔角膜基质细胞种植于两种载体，体外培养2周，形成细胞载体复合物。对构建的角膜组织进行苏木精-伊红染色、扫描电镜观察；同时将两种生物材料移植到兔角膜基质囊袋内，观察其生物相容性。结果角膜基质细胞在两种载体上皆可黏附生长，并分泌细胞外基质。脱细胞基质载体内细胞形态不规则，位于胶原板层间，形成类似正常组织的角膜基质结构；细胞可在几丁糖网状纤维上黏附并包绕生长。两种载体移植到兔角膜囊袋后，脱细胞基质降解较慢，与宿主角膜组织相融性良好，未发生明显排斥及毒性反应；几丁糖载体降解较迅速，但降解产物诱导较严重的排斥反应。结论异种角膜脱细胞基质保留正常组织的胶原板层结构，并具角膜的韧性和良好的生物相容性，更适于作为体外构建生物角膜的载体，而几丁糖材料则需要在构成结构和性能等方面进一步改进．     

异种角膜脱细胞基质为供体进行角膜前板层移植的初步研究

目的探讨以异种猪角膜脱细胞基质为供体植片,分析兔角膜进行前板层移植后的生物相容性：设计实验研究。研究对象新西兰白兔。方法应用1％TritonX-100及冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,切取1／3厚度前板层作为供体角膜植片,对兔眼角膜前板层切除后进行移植,同时以新鲜猪角膜板层为供体对兔进行前板层移植作对照。通过术后角膜透明度、组织结构观察,评价猪角膜脱细胞基质的生物相容性及植片转归的情况。主要指标角膜透明度和组织学HE染色。结果制备的猪角膜脱细胞基质植片作前板层移植到兔眼后,未见明显的新生血管、炎症反应、角膜坏死等排斥现象,观察期内植片较透明;脱细胞基质表面上皮化良好,植片基质板层与植床逐渐融合,植片内有宿主细胞迁入生长,板层结构与正常角膜相似。结论猪角膜脱细胞基质具有良好的生物相容性、安全性和低抗原性,有望成为角膜板层移植的供体材料。     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

以异种角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮-载体-内皮复合物的实验研究

目的探讨以异种角膜脱细胞基质为载体,体外构建生物角膜的可能性和方法。方法应用去垢剂1％TritonX-100冷冻干燥处理制备猪角膜脱细胞基质载体,在其上皮面和内皮面分别接种兔角膜上皮细胞和内皮细胞,体外培养2周。将复合物制成组织切片,在光镜下观察组织形态（HE染色）,采用免疫组织化学方法检测角膜上皮特异性细胞角蛋白3（CK3）,使用锥虫蓝联合茜素红染色观察内皮细胞,在扫描电镜下观察上皮面和内皮面的超微结构。结果体外培养生物角膜获得上皮、无细胞基质和内皮三层复合结构。4或5层复层上皮中以扁平细胞为主,胞质内特异性CK3表达阳性;内皮层为一连续的单层扁平细胞,细胞活性良好,锥虫蓝联合茜素红染色显示组织呈典型的蜂巢样镶嵌结构。扫描电镜下观察,在载体的上皮面细胞呈复层样生长,形态近似扁平与梭形之间;内皮面为多边形单层细胞,表面具有微绒毛结构。结论构建的生物角膜为上皮一脱细胞基质载体一内皮复合物,初具角膜的雏形结构。异种角膜脱细胞基质提供了良好的细胞生长界面,有望成为体外构建角膜的载体材料。     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

羊膜载体培养标记兔角膜内皮细胞移植的研究

目的探讨以羊膜基底膜为载体培养兔角膜内皮细胞移植的可能性,为培养内皮细胞移植治疗角膜内皮失代偿疾病提供依据与方法。方法体外培养扩增兔角膜内皮细胞,采用亲脂性碳青染料(CM-DiI)对细胞进行标记,种植于去除上皮细胞的羊膜基底膜上,体外培养形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学、超微结构及细胞标记情况的观察;将羊膜为载体培养的内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植和单纯角膜后板层切除为对照,术后观察角膜透明度与厚度,对其进行组织学与细胞标记情况的检测。结果 5～7d 角膜内皮细胞即在羊膜基底膜上融合成单层,细胞为扁平多角形,排列紧密,密度可达(3202.84±347.77)个/mm~2,荧光显微镜下可见内皮细胞被 CM-DiI 标记后显现红色荧光;培养内皮层移植后角膜维持相对的透明与薄度,而无内皮细胞羊膜移植和单纯后板层切除两组对照角膜严重水肿、混浊,厚度明显超过实验组角膜;培养内皮移植后角膜形成新的内皮层,通过标记的细胞发现移植后细胞仍为培养移植的内皮细胞而非周边细胞的移行。结论羊膜基底膜是角膜内皮细胞生长和移植的良好载体,体外培养角膜内皮细胞移植有望代替供体角膜移植,具有广阔的应用前景。(中华眼科杂志,2006,42:925-929)     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

使用猪角膜脱细胞基质的人板层角膜移植治疗真菌性角膜炎的临床观察

目的:观察猪角膜脱细胞基质构建的生物角膜支架用于人角膜板层移植术治疗药物难以控制的浅层真菌性角膜炎的效果.方法:对2015-06/2016-03我院收治的16例16眼真菌性角膜炎患者的临床资料进行回顾性分析.16例真菌性角膜炎进行猪角膜脱细胞基质移植,术后随访6mo.对患者术后视力、角膜植片情况、并发症及复发情况进行分析.结果:术后7~10d植片角膜上皮化.16例病例术后1mo角膜水肿,1mo后角膜水肿消失,角膜逐渐透明.术后1mo有2例出现术眼角膜上皮缺损,药物治疗均恢复.术后出现眼压高3例,给予降眼压治疗后眼压控制.随访期间未出现角膜溶解、感染复发、排斥现象.术后1、3、6mo视力分别为1.27±0.22,1.11±0.13,0.79±0.22,术后视力均较术前明显提高,术后1mo视力与术前相比无统计学差异(P=0.06),术后3、6mo视力与术前相比具有明显统计学差异(P=0.01、0.001);其中术后3mo与术后1mo视力相比无明显提高,结果无统计学差异(P=0.11),而术后6mo视力较术后1、3mo均有明显提高,结果具有显著统计学差异(P<0.001).结论:猪角膜脱细胞基质移植治疗真菌性角膜炎是安全、有效的方法.