SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.     

抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

[目的]构建真核表达体系,提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv 637)与人血清白蛋白(HSA)融合基因(ScFv 637-HSA)的蛋白表达质量.[方法]扩增ScFv 637-HSA融合基因,经酶切处理后,克隆至真核载体pPIC9 K,线性化处理后,电穿孔入毕赤酵母GS 115.[结果]经电泳观察可见相对分子质量为2.6 kbp的融合蛋白ScFv 637-HSA基因和真核表达载体pPIC9 K基因片段.[结论]ScFv637-HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中.     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合轻链在巴氏毕赤酵母的高效分泌表达

目的: 通过整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌mAb HAb18的cFab的嵌合轻链.方法: 将抗人肝癌mAb cFab/HAb18原核表达载体pET32a/cFab中的cL亚克隆到酵母表达载体pPIC9K,构建成重组质粒pPIC9K/cL测序鉴定.重组质粒pPIC9K/cL整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后,用含5 mL/L甲醇的培养基诱导表达.结果: 该系统成功表达了抗人肝癌mAb HAb18cFab的嵌合轻链,表达水平为22 mg/L;Western Blotting证实,表达产物具有良好的HAb18GE结合活性和特异性.结论: 嵌合轻链/HAb18在巴氏毕赤酵母获得成功表达,为高效分泌表达cFab抗体奠定了基础.     

抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定

[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFvA7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.     

重组小鼠凝血因子Ⅶ毕赤酵母表达载体的构建及整合体的筛选

目的构建无凝血活性的重组小鼠凝血因子Ⅶ(rmFⅦ)毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得rmFⅦ蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法PCR扩增得到mFⅦ基因片段,插入酵母表达载体pPIC9K的α分泌信号开放阅读框的下游,再经定点突变(K341A)得到pPIC9KrmFⅦ,测序正确的质粒用SacⅠ线性化后电穿孔转化毕赤酵母GS115,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合。结果获得了rmFⅦ毕赤酵母表达载体pPIC9KrmFⅦ,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。结论成功构建了rmFⅦ毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化rmFⅦ蛋白及后续研究奠定了基础。     

小鼠FSH-Occludin重组多价避孕疫苗的构建及表达

目的 构建FSH与Occludin重组基因的毕赤酵母分泌型表达载体.方法 利用RT-PCR技术,从小鼠新鲜脑组织中提取总RNA扩增获得FSH-β亚单位,同法从小鼠新鲜睾丸组织中提取总RNA扩增Occludin,通过双重PCR扩增,获得含FSH-β亚单位特定基因序列和闭锁因子第2个胞外环序列的耦合片段, 构建两种重组质粒pPIC9K FSH-Occludin;经酶切鉴定后电转化毕赤酵母菌株GS115,YPD-G418平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后SDS-PAGE电泳鉴定.结果 通过双酶切分析、DNA测序鉴定明确特定的FSH-β亚单位和Occludin基因耦合片段序列与设计完全一致.目的蛋白相对分子质量分别约为14×103与12×103 ,与理论预测值相吻合;Western blot检测具有良好的免疫反应性.结论 耦合片段被成功克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPIC9K中并高效、正确的表达.     

一种β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因(BGL1)，为β-葡萄糖苷酶基因的表达作准备。方法：用PCR方法从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因连接到pGEM--T载体上，用限制性内切酶切下目的基因，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使之位于α-因子信号肽下游，且与之同框，构建成重组质粒pSHL9K。再将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行克隆，并进行鉴定。结果：重组pPIC9K转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母后，进行酶切和PCR鉴定，证明形成了目的基因的克隆。结论：应用大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母作为受体菌，pPIC9K为载体，成功克隆了β-葡萄糖苷酶基因。     

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1active center电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1active center,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.     

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5'-非转录区(5'-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响.方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5'-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化.结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72 h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍.结论:pPIC9 5'-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达.     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定.方法用PCR从pET-28a( )/HSPC016中扩增出195 bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Western blot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定.结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7.2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Western blot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致.结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础.     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

【目的】山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。【方法】利用PCR点突变方法改造山蛭素基因 ,将山蛭素基因克隆到pGEM Teasy载体中。对重组质粒测序 ,构建了毕赤酵母表达载体 pPIZB Hs ,然后转化有活性的GS115酵母菌株 ,筛选表达酵母菌株GS115 ,摇瓶发酵。【结果】改造的山蛭素基因在重组酵母中表达 ,重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。【结论】利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因 ,并能在毕赤酵母中表达     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.