UCH—L1基因敲除小鼠的饲养、繁殖及鉴定

目的饲养、繁殖和鉴定泛素羧基末端水解酶L1（UCH．L1）基因敲除小鼠,获得UCH—L1基因敲除纯合子小鼠,为深入研究UCH．L1的生物学功能奠定基础。方法从美国购进的UCH．L1基因敲除小鼠经适应性饲养1周后,将1只雌性杂合子和1只雄性杂合子小鼠合笼饲养并繁殖,剪取子代小鼠尾尖部0．5cm组织,提取基因组DNA,PCR方法鉴定其基因型。雄性杂合子与雌性杂合子交配生产后代中,野生型和UCH—L1基因敲除纯合子小鼠用于后续的生物学功能研究：杂合子小鼠用于繁殖。观察UCH—L1基因敲除纯合子小鼠的表型变化,并利用免疫印迹法验证UCH—L1基因敲除的效果。结果小鼠成功繁殖后,利用杂合子交配共生产370只小鼠,其中UCH．L1＋/-占34．1％、UCHL1＋/-占50．5％、UCH．L1-/-占15．4％,成功获得UCH-L1基因敲除纯合子小鼠,并建立了饲养、繁殖和鉴定方法。结论采用雌性和雄性UCH—L1基因敲除杂合子小鼠交配．不仅可以获得UCH—L1基因敲除纯合子小鼠,而且有利于长期饲养与繁殖。     

UCH-L1对急性低压低氧小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平的调控作用

目的探讨急性低压低氧条件下UCH-L1基因敲除对小鼠海马中α-突触核蛋白(α-Syn)表达水平的影响及其机制,为治疗α-Syn蛋白相关的神经系统疾病提供依据。方法采用UCH-L1基因杂合子(UCH-L1~(+/-))小鼠雌雄交配的方式获得UCH-L1基因敲除纯合子(UCHL1~(-/-))小鼠和野生型小鼠(UCH-L1~(+/+)),PCR法鉴定小鼠的基因型。将UCH-L1~(+/+)小鼠和UCH-L1~(-/-)小鼠放入低压氧舱模拟海拔8000 m高度,持续低氧8 h,建立急性低压低氧模型。采用Western Blot法检测小鼠海马中UCH-L1、α-突触核蛋白及LC3蛋白表达水平的变化,观察UCH-L1基因敲除对α-突触核蛋白表达水平及其相关细胞自噬降解通路的影响。结果与对照组(0.702±0.121)相比,急性低压低氧可诱导野生型小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(1.310±0.096)显著升高(P0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ的比值轻度升高,而对UCH-L1蛋白的表达水平没有影响。当敲除UCH-L1基因的小鼠经急性低压低氧处理后,小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(0.952±0.093)明显低于野生型对照组(1.490±0.074)(P0.05),同时LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也显著升高(P0.05)。结论UCH-L1基因敲除降低了急性低压低氧诱导的α-突触核蛋白表达水平升高,其机制之一可能与小鼠在急性低压低氧时因敲除UCH-L1基因而进一步促进细胞自噬通路的活化有关。     

VSMC-Cx43-/-条件性基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^-/-)模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^flox/+)。将获得的flox杂合子Cx43^flox/+小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^flox/flox小鼠。然后用Cx43^flox/flox小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^-/-)和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^flox/flox)。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^-/-基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。     

低密度脂蛋白受体基因多态性与高脂血症的关系

目的　探讨上海市城市社区高血压人群中低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因多态性与高脂血症的关系。方法　运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测107例高脂血症、104例临界高脂血症和108例正常血脂的LDL-R基因多态性。结果　发现LDL-R基因型有3种,即(+/+)型、(+/-)型、(-/-)型。男性,3组均有(+/+)基因型,高脂血症组2例,临界高脂血症组和正常血脂组均为1例。高脂血症组、临界高脂血症组、正常血脂组(+/-)基因型频率分别为41.18%、46.15%、19.05%,3组(+)等位基因频率分别为24.51%、25.00%、11.11%。高脂血症组和临界高脂血症组(+/-)基因型频率及(+)等位基因频率均高于正常血脂组(P＜0.05);女性,3组均无(+/+)基因型,且3组基因型及等位基因频率差异无显著性(P＜0.05)。单因素和多因素非条件logistic回归分析显示男性LDL-RAvaⅡ(+/+,+/-)基因型与高脂血症(OR=3.08)、临界高脂血症(OR=3.82)关联显著。结论　上海市城市社区高血压人群中男性高脂血症LDL-R基因(+/-)基因型显著高于正常血脂组,(+)等位基因频率也明显高于正常血脂组,说明LDL-R基因多态性与高脂血症发生有一定关系,LDL-R基因可能是高脂血症的易感基因之一。     

甲状旁腺激素在肥胖形成中的作用

目的探讨甲状旁腺激素(PTH)基因敲除对小鼠体重、体脂的影响。方法 C57/BL6小鼠30只,按基因型随机分成PTH-/-为基因敲除纯合子小鼠;PTH+/-为基因敲除杂合子小鼠和PTH+/+为野生型小鼠共3组,每组10只,雌雄各半。观察其体重及日均摄食量情况。18w龄处死。用电子天平测小鼠脏器重量、并计算脏器系数,用全自动生化分析仪检测血糖、血脂等血液学指标。结果雌雄间各基因型小鼠体重生长在各时间点均无显著性差异(P>0.05);日均摄食量无脏器重量和系数及血糖、血脂水平也均无显著性差异(P>0.05)。结论 PTH基因敲除小鼠的体重、脏器重量和系数及血糖、血脂指标均无明显改变,提示PTH可能并不参与体重和体脂变化过程。     

CRISPR系统特异性敲除目的基因在肝病小鼠模型中的应用

目的 利用腺相关病毒(AAV)转导和CRISPR技术建立肝脏相关疾病小鼠模型.方法 AAV-绿色荧光蛋白(GFP)表达系统(AAV-GFP)和CRISPR靶向基因敲除质粒系统(px330-sgGFP-Cas9),三组FVB/NJ小鼠采用尾静脉高压水动力注射技术分别注射生理盐水(对照组)、AAV-GFP(AAV-GFP组)、AAV-GFP+px330-sgGFP-Cas9(sgGFP组),采用小动物活体成像仪检测小鼠肝脏GFP表达情况.结果 生理盐水对照组小鼠肝脏不表达GFP;AAV-GFP组小鼠肝脏72 h后开始表达GFP,2周后GFP表达稳定;sgGFP组在第9、12天均表达GFP蛋白,但2周后GFP蛋白明显减弱.结论 本研究所构建的AAV-GFP表达系统能够在小鼠肝脏中稳定表达GFP.所构建的CRISPR质粒系统可以特异性敲除小鼠肝脏所携带的目的基因,建立合适的肝脏疾病研究模型.     

金属硫蛋白降低铅致新生仔鼠脑组织的氧化损伤

目的　应用金属硫蛋白基因敲除小鼠模型 ,研究孕鼠铅暴露 ,新生仔鼠脑组织氧化损伤与金属硫蛋白 (MT)间的关系。方法　采用整体动物实验 ,于金属硫蛋白基因敲除小鼠 [MT(- / - ) ]和野生型小鼠[MT(+/ +) ]孕第 0天至妊娠结束进行醋酸铅灌胃染毒 ,仔鼠出生后第 1天处死 ,取脑组织测定丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽 (GSH)含量及超氧化物歧化酶 (SOD)活力 ,同时测定脑组织中MT的含量。结果　宫内铅暴露使MT (+/ +)及MT (- / - )新生仔鼠脑组织MDA含量升高 ,SOD活力降低 ,与染铅剂量间存在明显的剂量 -效应关系 (P <0 0 1)。相同醋酸铅染毒剂量间比较结果显示 ,对照组、低及中剂量染铅组MT (- / - )仔鼠脑组织MDA含量明显高于MT (+/ +)仔鼠 ,差异具有显著性 (P <0 0 1)。随染铅剂量的增加 ,MT (+/ +)仔鼠脑组织GSH含量单向性升高 ;而MT (- / - )仔鼠脑组织GSH含量的变化为非单向性 ,表现为低、中剂量升高 ,高剂量时下降的趋势。高剂量染铅组MT (+/ +)仔鼠脑组织MT含量明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论　MT在体内铅的转运、代谢乃至解毒方面具有一定作用 ,MT的缺乏可使铅引起的脑组织脂质过氧化反应增强 ,进一步加重铅的神经发育毒性。     

肝脏GPAT4基因敲除小鼠模型构建

目的 为胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝(NAFLD)发病与甘油-3-磷酸酰基转移酶-4(GPAT4)后续相关研究提供肝脏GPAT4基因敲除小鼠模型。方法 选择C57BL/J6雌性与雄性小鼠各10只及白蛋白启动子调控的Cre转基因(Alb-Cre)小鼠作为研究对象。采用Cre/LoxP基因打靶策略,构建基因打靶载体,引入LoxP位点,获得基因同源重组胚胎干细胞(ES);将ES植入小鼠,分别获得嵌合鼠、杂合子、纯合子小鼠。最终获得肝脏特异性GPAT4敲除小鼠。基因分型实验对第8外显子下游的loxP位点设计基因型鉴定引物,以便进行批量快速基因型分析;随机抽取3只小鼠进行解剖,从高表达GPAT4的小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪提取总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测组织中GPAT4 mRNA表达;在小鼠的肝脏组织中提取总蛋白,使用蛋白质印迹法检测肝脏GPAT4表达,进一步验证肝脏GPAT4的敲除效果。结果 成功组装靶向载体,且GPAT4基因位于小鼠第8号染色体;酶切分析结果显示,6条带为线性后的靶标载体,线性载体在电泳中相对分子质量最大、速度最慢;导入ES后,确认了6个潜在...     

鞘氨醇激酶(SphK1)基因敲除小鼠的饲养繁育及基因鉴定

目的通过对鞘氨醇激酶(Sph K1)基因敲除小鼠的繁殖和鉴定,以提供Sph K1缺失对各种疾病的影响的相关理想动物模型。方法将从美国国立健康研究院(National Institute of Health,NIH)处引进的Sph K1敲除杂合子小鼠进行交配,获得子代小鼠后,提取小鼠尾部的DNA,用琼脂糖电泳等方法检测及验证子代小鼠基因型。结果获得纯合子子代小鼠。结论 Sph K1基因敲除小鼠的鉴定获得成功。     

碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠,为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代小鼠耳缘组织于EP管中,用碱性裂解液提取基因组DNA,PCR扩增COX-1和COX-2基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定,即野生型（COX-1＋/＋;COX-2＋/＋）、杂合子（COX-1＋/-;COX-2＋/-）和纯合子（COX-1-/-;COX-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法,并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1(CAV-1)基因敲除的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),并验证其对流行性乙型脑炎病毒(JEV)的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,基于人源CAV-1基因的外显子区(EXON)序列设计小向导RNA(sgRNA),将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SHSY5Y细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞,并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定,重组真核表达质粒构建正确,转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达,成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比,CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%(P0.001)。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株,该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。     

Herpud1在盆底肌萎缩模型中的表达研究

目的 探讨内质网膜蛋白Herpud1在盆底肌萎缩模型中的表达与作用。方法 分别各取10只4月龄未生产过的野生型C57BL/6J小鼠(WT组)和盆底肌萎缩模型基因小鼠(T型钙离子通道编码基因CACNA1H敲除小鼠：Cacna1h-/-mice/TH-null组),异氟烷麻醉小鼠后,电生理记录仪对小鼠进行尿动力学指标的检测;处死小鼠后取盆底肌行免疫组化染色和Western-blot实验,分析Herpud1蛋白和mRNA水平的表达变化。选择鼠源C2C12成肌细胞分化4 d形成肌管后,予以T型钙离子通道抑制剂NNC 55-0396水合物(NNC)处理24 h和48 h,构建肌管萎缩细胞模型,Western-blot法检测Herpud1蛋白表达。结果 小鼠尿动力学检测结果显示,与WT组小鼠相比,TH-null组小鼠膀胱漏尿点压(bladder leak point pressures, BLPP)值[(46.54±1.102)cmH₂O vs (31.55±2.177)cmH₂O]、最大膀胱容量值(0.1145±0.003023 vs 0.0691±0...     

TIP30基因敲除小鼠EGFR下游信号通路活性

目的探讨TIP30基因敲除后是否影响小鼠EGFR下游信号通路的活性。方法获取野生型及TIP30基因敲除的BALB/c小鼠乳腺组织及乳腺癌组织,用免疫组化检测EGFR下游信号通路相关分子pAKT及pErk1/2的表达。结果 Tip30~(-/-)小鼠乳腺上皮细胞pErk1/2及pAkt阳性率分别为(27.83±8.46)%和(30.83±6.65)%(n=4),显著高于Tip30~(+/+)小鼠乳腺上皮细胞的(12.58±5.87)%和(14.94±5.77)%(n=4),P值分别0.02和0.011。而Tip30~(-/-)小鼠乳腺肿瘤细胞pErk1/2及pAkt阳性率分别为(51.68±8.57)%和(56.08±8.44)%(n=4),则显著高于Tip30~(-/-)小鼠乳腺上皮细胞阳性率,P分别为0.002和0.001。结论 TIP30基因缺失可能通过使EGFR下游ERK/MAPK及PI3K/AKT信号通路的活化,从而导致TIP30基因缺失小鼠发生乳腺癌。     

CYP1B1基因敲除对成年小鼠肝脏脂肪代谢的影响及可能机制

目的探讨CYP1B1对高脂膳食诱导的成年小鼠脂肪代谢的作用。方法 CYP1B1基因敲除(KO)和野生型(WT)雄性成年C57/BL小鼠(6 w龄)各16只,给予低脂(LFD,30%)、高脂肪(HFD,60%)饲料共6 w。小鼠处死后取血清、附睾脂肪和肝脏组织检测相应的生化和分子生物学指标。结果 6 w高脂膳食后,KO小鼠能量摄入总量稍高于WT小鼠,但其体重增量和附睾脂肪组织重量均显著低于WT小鼠;WT小鼠脂肪细胞直径明显大于KO小鼠,且血糖、血清及肝脏组织中甘油三酯(TG)水平亦明显高于KO小鼠;肝脏组织RT-PCR结果显示,CYP1B1基因敲除后,启动脂肪形成的核因子及脂肪合成相关基因如CD36、SREBP1c、SCD1等表达下降,而调控脂肪氧化分解的基因如CPT-1α,UCP-2表达显著上升;蛋白印迹结果显示,CYP1B1基因敲除增强腺苷-磷酸激酶(AMPK)的磷酸化。结论 CYP1B1基因敲除对成年小鼠营养性肥胖的保护作用可能与AMPK磷酸化增强并调控肝脏中脂肪代谢相关基因的表达有关。     

过氧化物酶体生物发生因子5(PEX5)缺失导致小鼠精子发生失败和不育

目的：过氧化物酶体生物发生因子5(PEX5)对雄性小鼠精子发生及生育功能的影响。方法：利用CRISPR/Cas9及LoxP/Cre技术构建睾丸特异性Pex5基因敲除(Pex5 cKO)小鼠模型,通过苏木精-伊红染色(HE)、免疫蛋白印迹(Western blot)和免疫荧光(IF)染色分析评估雄性小鼠的生殖器官及精子发生的情况。结果：Pex5 cKO雄性小鼠正常成熟交配窝仔数为0,与野生型(WT)雄性小鼠窝仔数(6.32±0.26)相比差异有统计学意义(t=21.46,P<0.0001),且HE染色结果发现,Pex5 cKO小鼠附睾中无精子发生。结论：PEX5在小鼠精子发生过程中发挥重要作用。     

CYP1B1对肥胖小鼠脂肪组织血管新生因子影响

目的 探讨血管新生因子血管生成素Ⅰ和Ⅱ在保护幼年细胞色素P4501 B1(CYP1 B1)基因敲除小鼠营养性肥胖中作用.方法 CYP1 B1基因敲除和野生型雄性C57/BL小鼠(3周龄)各16只,给予低脂膳食(10％脂肪)、高脂膳食(60％脂肪)饲料11周;小鼠处死后取附睾脂肪组织检测血管密度及血管新生因子基因和蛋白表达.结果 野生高脂组小鼠脂肪组织血管密度下降,基因敲除小鼠脂肪组织血管分布不受影响;高脂膳食诱导下,野生型和基因敲除小鼠血小板-内皮细胞粘附分子CD31 mRNA表达下调(P＜0.05),野生型小鼠CD31蛋白表达下调(P＜0.05);与野生低脂组比较,高脂诱导后野生型和基因敲除小鼠血管生成素Ⅰ表达量分别为0.35和0.50(P ＜0.05),瘦素表达量则分别为2.48和1.42(P＜0.05);敲除高脂组瘦素表达量较野生高脂组下降(P＜0.05).结论 CYP1B1基因敲除对血管新生相关因子的调控可能在其营养性肥胖中起一定保护作用.     

辐射诱发胸腺淋巴瘤与Ikaros及p16基因多态性

目的 探讨Ikaros及p16基因多态性与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的相关性.方法 采用Promega公司基因组DNA纯化试剂盒提取胸腺淋巴瘤细胞基因组DNA.采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-PEEP)方法检测Ikaros基因rs28185870位点(C/T)、rs28185923位点(C/T)及p16基因rs3695947位点(A/G)单核苷酸多态性(SNPs).结果 C57BL/6J及BALB/c小鼠rs28185870位点基因型分别为T/T、C/C;rs28185923位点基因型分别为C/C、T/T;rs3695947位点基因型分别为A/A、G/G.结论 辐射敏感性不同的C57BL/6J、BALB/c小鼠的rs28185870、rs28185923及rs3695947位点基因型不同,推测Ikaros及p16基因多态性与辐射诱发胸腺淋巴瘤相关.     

载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及病理组织学观察

目的观察载脂蛋白E（ApoE-/-）基因敲除小鼠血脂及病理组织学变化。方法选择24只ApoE-/-基因敲除小鼠,雌雄各半,另选同龄的雌雄各半C57BL/6J小鼠24只为对照,观察小鼠血脂及心脏病理形态学变化。结果 ApoE-/-基因敲除小鼠组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与对照组相比无差异（P〉0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠组动脉粥样硬化斑块大小较对照组明显增高（P〈0.05）;ApoE-/-基因敲除小鼠心肌发生粥样硬化病变改变。结论 ApoE-/-基因敲除小鼠更容易引起动脉粥样硬化病灶形成。     

小鼠Pkd2基因条件性敲除打靶载体的构建

[目的]构建小鼠Pkd2条件性基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础.[方法]以正常小鼠(129×1/SvJ)基因组DNA为模板,扩增小鼠Pkd2基因一段包括第9号外显子的长为9.3kb的序列,通过引入LoxP和Neo基因等步骤,建立条件性敲除Pkd2第9号外显子的条件性基因打靶载体.[结果]经多个限制性核酸酶酶切鉴定和测序证实,所构建的Pkd2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求.[结论]成功构建小鼠条件性Pkd2基因敲除打靶载体,为建立Pkd2基因条件性敲除小鼠模型奠定基础.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜20肽重组蛋白的表达和鉴定

目的利用基因重组技术构建原核质粒表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜20肽重组蛋白(SA0587),为进一步研究其生物学作用和构建小鼠Ig A肾病动物模型提供重要条件。方法以SA0587的序列为参照,设计出SA0587基因,构建p ET28a-SA0587-GFP重组质粒,以NcoⅠ/XhoⅠ为酶切位点进行双酶切鉴定,同时将符合预期的单克隆进行基因测序,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中;挑取单菌落培养活化后,用诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白SA0587;通过SDS-PAGE电泳及Western blot实验鉴定目的蛋白。结果成功构建了重组质粒并进行双酶切鉴定和基因测序,重组质粒大量诱导表达目的蛋白后镍胶纯化,通过SDSPAGE电泳及Western blot实验鉴定目的蛋白为SA0587。结论实验表达和鉴定了SA0587,为后期Ig A肾病小鼠模型的建立提供必要条件。