IL-2和IL-15诱导扩增的脐带血NK细胞生物学特性研究

本研究探讨脐血CD3-CD56+NK细胞及其在IL-2、IL-15诱导扩增后的免疫表型、细胞毒活性等生物学特性的改变。分离脐血单个核细胞,在无血清培养条件下,分别加入IL-2或(和)IL-15,培养14 d,流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞亚群水平以及NK表面CD16、CD62L、NKG2D、NKG2A、NCR44、NCR46、颗粒酶B、穿孔蛋白的表达;用WST-1法检测NK细胞对K562细胞毒活性。结果表明,扩增14 d后IL-2、IL-15、IL-2/IL-15 3组NK细胞分别扩增了10.78±2.51、10.42±3.72、10.54±6.24倍,3组之间无显著差异;扩增后的NK细胞表达CD16的比例显著减低,IL-2和IL-15组之间差异显著;细胞因子扩增后CD62L表达无改变;IL-2有下调NKG2A、NCR46表达的作用,IL-15的作用则相反;两种细胞因子均有上调NKG2D、穿孔蛋白、NCR44表达的作用,且细胞因子之间也存在差异;IL-15有上调NK细胞颗粒酶B表达的作用;经细胞因子扩增的NK细胞毒活性显著增高,但细胞因子之间作用无显著差异。结论:在无血清培养条件下,IL-2和IL-15均能有效地扩增脐血中NK细胞。虽然2种细胞因子扩增后的CD3-CD56+NK细胞与功能相关的免疫表型呈现出不同的改变特征,但细胞毒活性均显著增加,且2种细胞因子之间作用无显著差别,协同作用不明显;NK细胞毒活性是各种活性分子共同作用的结果。     

高纯度CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。     

体外高效活化扩增人脐带血来源自然杀伤细胞的两种体系的比较研究

目的:探讨人脐带血来源的单个核细胞(h UC-MNC)，经两种体外培养体系活化扩增后的人脐带血自然杀伤细胞(h UC-NK)在生物学表型和细胞毒性上的异同。方法:收集健康供者捐赠的脐带血，经淋巴细胞分离液介导的密度梯度离心法富集单个核细胞。基于本课题组近期建立的3因子体系(定义为“3IL”)，比较Miltenyi和XVIVO 15两种培养基体外培养14 d后NK细胞(分别定义为M-NK和X-NK)的细胞表型、细胞亚群、细胞活力及细胞毒功能的相似性和差异性。结果:经上述2种体系诱导14 d后，总CD3^-CD56⁺NK细胞比例由4.25%±0.04%(d 0)提高至71%±0.18%(M-NK)和75.2%±1.1%(X-NK)。与X-NK组相比，M-NK组CD3⁺CD4⁺T和CD3⁺CD56⁺NKT细胞比例显著降低。X-NK组中表达CD16、NKG2D、NKp44、CD25活化型标志物的细胞比例更高，但M-NK组总NK细胞扩增数量为X-NK组的2倍。两组在N...     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。     

以肝素和抗CD16抗体为基础的扩增人脐血NK细胞无血清培养体系的建立

目的:建立一种新方法以用于体外培养扩增人脐血来源的NK细胞,从而为NK细胞的治疗奠定基础。方法:收集人脐血单个核细胞,将细胞按1.5×10~6/ml悬浮于含5%自体血浆、重组人IL-15(50 ng/ml)和氢化考的松琥珀酸钠(5×10~(-8)mol/L)组成的无血清培养液中,接种于含肝素钠或/和重组抗人CD16单克隆抗体铺板(预先铺板)的培养瓶中,其剂量分别为100 U/cm~2和1μg/cm~2底面积。培养2周后收集细胞,计细胞总数,应用流式细胞术检测细胞中CD3~-/CD56~+比例。以K562细胞为靶细胞,应用MTT实验观察不同效靶比条件下的NK的细胞毒作用。结果:与未铺板培养体系比较,抗CD16抗体及肝素钠铺板体系培养的细胞,在培养1周内易见贴壁的集落。培养2周后,预先铺板组细胞扩增倍数明显高于未铺板组,且CD3~-/CD56~+比例显著升高,尤以抗体和肝素混合铺板组为显著(P0.01)。MTT实验显示,预先铺板培养组所获得细胞对K562细胞的杀伤活性更强。结论:利用肝素和抗CD16抗体铺板,在培养体系中加入IL-15和氢化考的松,可使NK细胞优势扩增,从而获得纯度较高、细胞毒活性较强的NK细胞。     

细胞因子联合高效扩增高纯度人外周血来源NK细胞并观察其细胞功能的变化

目的 探索从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法,并初步了解扩增后的NK细胞功能的变化.方法 采用免疫磁珠分选系统(miniMACS)阴性分选法,从外周血单个核细胞(PBMNC)中获得纯化的NK细胞,在干细胞培养基条件下,通过IL-2、IL-12和IL-15等细胞因子的不同组合,分别培养15 d,每3 d半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后NK细胞CD3-CD56+细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平及IFN-γ的分泌水平.结果 经miniMACS阴性免疫磁珠分选后CD3-CD56+细胞含量由分选前的(11.2±5.2)%提高到(94.2±3.5)%.培养15 d后除对照组CD3-CD56+细胞纯度略下降外,其余组与扩增前无明显差异(P0.05).在IL-2、IL-2+IL-12、IL-2+IL-15、IL-2+IL-15+IL-12培养体系中,NK细胞扩增倍数分别为15.4±1.1,19.9±3.9,50.5±4.3和52.4±6.7,均显著高于对照组(6.1±1.0)(P<0.01),但IL-2+IL-15与IL-2+IL-15+IL-12组间比较,差异无统计学意义(P0.05).各组培养的NK细胞穿孔素、颗粒酶B基因的表达量均较扩增前明显增加(P<0.01),IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组两种基因的表达量均显著高于其他组(P<0.01),但两组间比较差异无统计学意义(P0.05);各细胞因子组培养液中IFN-γ分泌水平均显著高于未加细胞因子的空白对照组(P<0.01),IFN-γ分泌水平IL-2+IL-12+IL-15组IL-2+IL-12组IL-2+IL-15组IL-2组(P<0.01).结论 经miniMACS免疫磁珠阴性分选法获得少量NK细胞后,应用IL-2+IL-15细胞因子联合培养是获得纯度高、细胞毒活性强、扩增效率高的NK细胞的简单有效方法.     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。     

IL-6、PHA联合磁珠分选对CIK增殖能力和杀伤肾癌786-O细胞功能的影响

目的通过体外实验研究白介素-6(IL-6)、植物血凝素(PHA)联合免疫磁珠(IMB)分选对CIK增殖能力和杀伤肾癌786-O细胞功能的影响,为肾脏肿瘤的免疫治疗提供理论依据。方法分离肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC),经Mini MACS免疫磁珠去除CD4+CD25+Treg细胞后分为4组:对照组以CD3 Mc Ab、IL-2和IFN-γ诱导培养;PHA-CIK组、IL-6-CIK分别在对照组的基础上加用PHA、IL-6;PHA-IL-6-CIK组在对照组的基础上加用PHA和IL-6。CCK-8法检测各组CIK细胞的增殖率;流式细胞术(FCM)检测各组CIK细胞CD3+CD8+、CD3+CD56+、Treg表型比例;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组CIK细胞对肾癌786-O细胞的杀伤功能。结果磁珠分选后,PBMC中Treg细胞的比例降低至(1.21±0.53)%;PHA-IL-6-CIK组细胞的增殖率达(28.33±3.05)%;PHA-IL-6-CIK组细胞的CD3+CD8+、CD3+CD56+比例分别升高至(63.13±2.70)%和(35.32±2.96)%,Treg细胞比例降低至(1.11±0.07)%;在效靶比为30:1时,PHA-IL-6-CIK组细胞对肾癌786-O细胞的杀伤率可达(42.76±3.40)%。结论 IL-6、PHA联合磁珠分选可显著增强CIK的增殖和杀伤肾癌786-O细胞能力。     

脐血单核细胞体外高效扩增NK细胞方法的研究

目的建立1种使用脐血单核细胞(UCBMC)制备较高纯度自然杀伤(NK)细胞的体外高效扩增方法,并初步鉴定扩增后的NK细胞杀伤肿瘤细胞(K562)的能力。方法 6人份脐血标本来自北京妇产医院,取20 mL/份、采用密度梯度离心法分离脐血中的UCBMC,提取后的UCBMC以1×10~6个/mL细胞在4 mL含有白细胞介素(IL)-2、IL-12、IL-15和IL-21的X-VIVO15中培养5 d,期间于d2和d3添加等体积含上述细胞因子的新鲜培养基; 800 g离心将细胞后转入含1 000 IU/ml IL-2和50 ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的X-VIVO15培养基中继续培养至14 d,800 g离心收获细胞。无血清RPMI1640重悬后通过台盼蓝染色法做细胞计数测定细胞的扩增倍数;流式细胞仪检测NK细胞重要表面标志物(CD56和CD16等)及与杀伤功能相关的重要分子[CD158a、CD158b、CD158e/k、CD69、CD314(NKG2D)、CD94、CD335(NKp46)、CD337(NKp30)、CD62L、CD226(DNAM-1)、CD57和CD336(NKp44)]的表达情况;胞内染色结合流式细胞仪测定细胞杀伤重要效应分子Perforin和Granzyme B的表达情况,并以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测扩增后的细胞对K562细胞的杀伤能力。结果 6份UCBMC培养14 d:活细胞总数从培养前的4×106个扩增至(3. 6—5. 5)×10~8个,扩增倍数91—137(116±13. 1); CD3-CD56+细胞(NK细胞)占比85. 6%—95. 5%(90. 2±3. 4)%;培养得到的NK细胞表面除表达CD56分子外,还表达CD16(91. 2±2. 6)%、CD158a(71. 4±4)%、CD158b(52. 1±2. 2)%、CD158e/k(50. 3±6. 9)%、CD69(95. 6±2. 8)%、CD314(NKG2D)(94. 2±1. 7)%、CD94(94. 1±2. 1)%、CD335(NKp46)(26. 6±4. 1)%、CD337(NKp30)(94. 6±1. 5)%、CD62L(12. 8±3. 4)%、和CD226(DNAM-1)(97. 6±1. 3)%,以及CD57(4. 2±0. 9)%和CD336(NKp44)(7. 1±1)%。胞内染色结果显示:90%扩增产物(细胞)内表达与NK细胞杀伤功能相关的Perforin(86. 9±2. 7)%和Granzyme B(94. 1±2. 9)%;体外细胞杀伤试验:扩增的细胞对K562在效靶比为5∶1和10∶1时对靶细胞(K562)具有明显的杀伤作用。结论成功建立了1种从UCBMC不经纯化直接制备高纯度NK细胞的方法——其培养的细胞中表达了NK细胞重要的功能性分子,对K562细胞具有杀伤能力。     

体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究

本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法,从外周血单个核细胞(PBMNC)得到纯化的NK细胞,随后在干细胞培液基条件下,通过IL-2、IL-12和IL-15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL-2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组(不加任何细胞因子),分别培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子;检测分选及扩增前后(CD3-CD56+)NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经:miniMACS阴性免疫磁珠分选后(CD3-CD56+)NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除对照组(CD3-CD56+)NK细胞纯度略下降外,其余4组与扩增前无显著性差异(P>0.05)。在IL-2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中,NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08,19.87±3.87,50.46±4.31和52.35±6.72,均显著高于对照组6.14±1.0(P<0.01),但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异(P>0.05)。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强,在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组,但两组间无显著性差异(P>0.05)。结论:经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后,应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。     

原因不明复发性流产患者外周血NK细胞亚群及细胞因子水平的研究

目的分析原因不明复发性流产患者调节性T(Treg)细胞分泌的细胞因子、外周血自然杀伤(NK)细胞亚群及辅助性T(Th)相关细胞因子水平。方法选取该院2018年2月至2019年2月收治的41例原因不明复发性流产患者作为实验组;选取同期于该院进行检查的41例健康早孕者作为对照组。检测两组人群Treg细胞分泌的细胞因子(TGF-β、IL-10)、NK细胞亚群(CD56~+CD16~-、CD56~+CD16~+、CD56~-CD16~+)及Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ,Th2型细胞因子IL-4、IL-10水平。结果实验组Treg细胞分泌的TGF-β、IL-10水平显著低于对照组(P0.05)。实验组CD56~+CD16~-、CD56~-CD16~+NK细胞亚群百分比显著低于对照组(P0.05),CD56~+CD16~+NK细胞亚群百分比显著高于对照组(P0.05)。实验组外周血IL-2、IFN-γ细胞因子水平显著高于对照组(P0.05);实验组IL-4、IL-10等细胞因子水平显著低于对照组(P0.05)。结论外周血Treg细胞分泌的细胞因子、NK细胞亚群及Th相关细胞因子水平可作为诊断原因不明复发性流产患者的重要参考指标。     

诱导扩增脐血单个核细胞为T/NK细胞的实验研究

目的　探索体外诱导脐血单个核细胞 (MNC)扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系。方法　脐血MNC在 6种培养体系中培养 4周 ,于各时间点用流式细胞仪测定细胞表面T/NK标志抗原的表达 ;测定有核细胞 (NC)数 ;并行细胞形态学鉴定及细胞毒功能实验。结果　脐血MNC在SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α +IL 2体系中培养 ,第 2 2天NC数达 (2 0～ 2 6 )× 10 6/ml;淋巴细胞占NC的比例和CD3 + T细胞占淋巴细胞的比例均达到 90 %以上 ,以CD8+ T细胞亚群为主 ,CD4+ T细胞亚群比例下降 ;CD56+ CD3 + NKT细胞和TCRγδ+ 细胞的比例分别由不足 2 %升高到 30 %～ 4 0 %和 10 %～ 15 %。CD3 -CD56+ NK细胞无扩增。培养后细胞在效靶比为 5 0∶1时对K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤率分别达75 %以上和 32 %～ 6 5 %。结论　本实验中体外诱导脐血MNC扩增分化为T/NK细胞的最佳培养体系为SCF +FLT 3L +IL 7+IL 15 +TNF α+IL 2 ,最佳扩增时间是培养后第 2 2天。     

IL-2/IL-15刺激后脐血NK细胞穿孔蛋白表达及其与细胞毒活性的关系

本研究旨在探讨脐血NK细胞的穿孔蛋白表达水平以及IL-2、IL-15作用下穿孔蛋白表达与NK细胞细胞毒活性的关系。采用CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法纯化脐血NK细胞,流式细胞术测定NK细胞纯度,通过IL-2、IL-2+IL-15两种细胞因子培养体系培养3天,流式细胞术测定培养前后穿孔蛋白表达水平;LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562的细胞毒活性(效靶比10∶1)。结果表明,纯化后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%。,以K562为靶细胞,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2+IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,新鲜纯化CB-NK穿孔蛋白表达率为(67.21±6.14)%,IL-2组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(84.55±3.8)%,IL2-+IL-15组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(87.22±2.2)%。穿孔蛋白表达率与NK细胞毒活性呈正相关(r=88.6,p<0.05)。IL-2组穿孔蛋白表达率与新鲜组差别有统计学意义,IL-2组与IL-2+IL-15组穿孔蛋白表达率差别无统计学意义。结论:促进穿孔蛋白表达是IL-2提高脐血NK细胞细胞毒活性的途径之一。     

抗体介导的高效CIK(AMHE-CIK)细胞体外诱导的数种优化方案的比较研究

目的:比较几种体外诱导和扩增抗体介导的高效CIK(AMHE-CIK)细胞的方案,寻找短期内获取大量具有肿瘤杀伤效应细胞的培养方法。方法:用健康人外周血单个核细胞(PBMNC),经CD3抗体激活后,分别添加不同的细胞因子(IL-2,IL-4,G-CSF,GM-CSF,IFN-γ,TNF-α)于体外培养14 d,观察细胞的形态学变化;依据流式细胞术所测得的各组细胞的表型结果,分别筛选出诱导DC的协同刺激因子和诱导CIK细胞的协同刺激因子;再依据添加不同细胞因子将细胞分成对照组IL-2组、1组(试剂A:IL-2、IL-4、GM-CSF;试剂B:IL-2、G-CSF、IFN-γ和TNF-α)和2组(试剂A:IL-2、IL4、GM-CSF;试剂B:IL-2、G-CSF、IFN-γ、TNF-α和IL4),体外培养7d,记录细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测细胞表型为CD3~+CD56~+和CD3~+CD8~+细胞比例。结果:经过7d体外诱导培养对照组和另3组细胞增殖倍数分别为1.57±0.01,4.17±0.16,5±0.47和7.17±0.24倍差异具有统计学显著性(P0.05);各组CD3~+CD8~+双阳性细胞分别为13.96±0.23%、26.33±0.55%、36.83±0.34%和35.88±0.16%,后3组均明显高于对照组(P0.05),1组和2组均明显高于IL-2组(P0.05)。各组CD3~+CD56~+双阳性细胞分别为11.03±0.28%、29.31±0.60%、39.96±0.38%、和29.33±0.54%,后3组均明显高于对照组(P0.05),1组明显高于IL-2和2组(P0.05)。结论:本研究优化得到的1组细胞培养方案可显著诱导抗体介导的高效CIK细胞数量的增殖和有效杀瘤细胞(CD3~+CD56~+和CD3~+CD8~+)的增殖。     

体外扩增的自然杀伤细胞特点及其杀伤活性研究

目的评价体外扩增的自然杀伤细胞(NK)表型、扩增倍数、杀伤活性以及安全性。方法利用NK细胞体外扩增试剂盒对外周血单个核细胞进行刺激,特异性扩增NK细胞,利用流式细胞术、杀伤实验等检测扩增后NK细胞的特点及抗肿瘤活性;并检测NK细胞外源性因子污染情况等。结果体外培养16~21 d后,细胞扩增500倍以上,总数可达1×1010以上,其中CD3-CD56+NK细胞占90%以上,扩增后的NK细胞对Ho8910、A549、K562、Hep G2及SK-MES-1细胞均有较高的杀伤活性。同时,扩增后NK细胞未检测到细菌、病毒、支原体等外源性病原体污染。结论 NK细胞具有较高的体外杀瘤活性且无外源性因子污染。     

膝关节骨性关节炎患者外周血自然杀伤细胞亚群比例变化研究

目的研究自然杀伤(NK)细胞亚群比例变化与膝关节骨性关节炎(knee osteoarthrosis,K-OA)的关系。方法补体裂解法分离K-OA组与对照组外周血NK细胞,酶免疫标记技术测定两种不同NK细胞亚群比例。结果与对照组比较,K-OA组CD16-CD56+比例减少,而CD16+ CD56+比例上升(P<0.05)。结论 K-OA的发生与具有杀伤活性的CD16+ CD56+ NK细胞亚群比例上升有关。     

膝关节骨性关节炎患者外周血自然杀伤细胞亚群比例变化临床分析

目的 研究自然杀伤(NK)细胞亚群比例变化与膝关节骨性关节炎(K-OA)的关系.方法 2010年1月至2011年6月在我院就诊的K-OA患者50例为K-OA组,无各种关节炎病史及自身免疫病史的健康人41名为对照组,补体裂解法分离研究对象的外周血.NK细胞,酶免疫标记技术测定两种不同NK细胞亚群比例.结果 K-OA组CD16- CD56+与CD16+ CD56+阳性率分别为(45.2±6.8)％和(27.5±3.8)％,而对照组分别为(56.1±8.2)％和(16.2±4.2)％.2组比较差异均有统计学意义(t值分别为6.27、9.32,P均＜0.05).结论 K-OA的发生与具有杀伤活性的CD16+ CD56+ NK细胞亚群比例上升有关.     

低温保存对人外周血单个核细胞免疫活性的影响

目的:探讨外周血单个核细胞的分离、冻存及复苏工艺,实现外周血单个核细胞的长久保存。方法:采集50岁以上健康志愿者外周血50-100 ml,应用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞;采用程控降温法逐级降温,将细胞保存于-196℃液氮中。根据冻存时间进行细胞复苏,分析其冻存前后活性、回收率与表型变化,最后与对照组(直接分离的未经冻存的外周血单个核细胞)一起,经体外激活扩增培养,对比其表型与扩增效率,分析冻存对细胞的影响。结果:Ficoll密度梯度离心后获得的单个核细胞活力为99.6%±0.4%,回收率58.4%±6.52%。冻存24个月后,复苏细胞回收率89.7%±3.82%。细胞经体外激活扩增培养,得到能够杀伤肿瘤细胞的细胞群扩增活化的自体淋巴细胞(AIL)(CD3~+CD8~+细胞毒性T细胞比例≥45%,CD3~+CD56~+NKT细胞比例≥10%,CD4~+CD25~+NKT细胞比例≤10%),其与对照组细胞在扩增能力、细胞纯度、细胞毒活性等方面无显著性差异。结论:体外人工分离的外周血单个核细胞经过长时间冷冻保存后仍可维持其高活性,并可诱导生成具有抗肿瘤活性的细胞群,该结果对单个核细胞保存、扩增活化的自体淋巴细胞的应用具有重要意义。     

不同细胞因子组合对脐血巨核细胞的体外扩增效应

目的　探讨在体外液体培养条件下不同细胞因子组合促进脐血单个核细胞向巨核系增殖分化的效应。方法　将TPO(thrombopoietin)、SCF(stemcellfactor)、SCGF(stemcellgrowthfactor)、IL- 3、EPO(erythropoietin)等细胞因子组合成不同的实验组,在无血清液体培养体系中,体外扩增脐血单个核细胞 (CBMC)14d。扩增后于不同时间点用流式细胞仪检测CD61 细胞的比例,同时计数活细胞数,从而求得较好的细胞因子组合组。结果　经 14d培养后,SCF TPO组扩增效果最好,活细胞总数和CD61 细胞数量分别增加了 3. 14±0. 62倍和 48. 40±5. 71倍,显著高于单用TPO组的 1. 81±0. 36倍和 18. 72±3. 73倍。TPO IL 3组使CD61 细胞数量增加了 25. 82±3. 88倍,但扩增后CD61 细胞比例仅为 9. 34% ±1. 92%,低于TPO组的12. 21%±2. 27%;TPO SCGF组和TPO EPO组的扩增效果与单用TPO组相比无统计学差异 (P>0. 05)。结论　SCF能协同TPO增强巨核系造血,增加培养体系中巨核细胞的纯度和数量。     

类风湿性关节炎患者外周血CD3~+ CD(16、56)~+ NK T细胞百分率的变化及意义

目的探讨CD3+CD(16、56)+自然杀伤(NK)T细胞在类风湿性关节炎(RA)患者外周血中的变化及意义。方法采用流式细胞术检测RA患者(病情活动组和病情稳定组)及健康人(对照组)外周血淋巴细胞中CD3+CD(16、56)+细胞的比例及CD3+CD(16、56)+淋巴细胞CD69的表达百分率。结果 RA病情活动组外周血CD3+CD(16、56)+NK T细胞的比例及NK T细胞CD69的表达百分率明显低于RA病情稳定组及健康对照组(P均<0.01);RA病情稳定组NK T细胞的比例及NK T细胞CD69的表达百分率与健康对照组差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 RA患者外周血中CD3+CD(16、56)+NK T细胞比例减少及活性受抑制可能参与了RA的发病过程,且可能与RA的病情活动性相关。