锌对L6细胞葡萄糖消耗量和蛋白激酶B/糖原合酶激酶3β表达的影响（英文）

目的以L6细胞为研究对象,观察锌对正常L6细胞及棕榈酸诱导的胰岛素抵抗L6细胞葡萄糖消耗量及胰岛素信号通路关键分子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase,GSK3β)表达的影响。方法培养L6成肌细胞,分化后用0.4 mmol/L棕榈酸作用24h造胰岛素抵抗细胞模型,用100 nmol/L胰岛素和不同浓度的锌(0,10,20,50,100μmol/L)作用3h,葡萄糖氧化酶法测定基础状态和胰岛素刺激状态下细胞对葡萄糖的摄取量;用100 nmol/L胰岛素和不同浓度的锌(0,10,20,50μmol/L)作用15 min,Western blot法检测磷酸化AKT及磷酸化GSK3β表达水平。结果 10⁵0μmo/L的锌能明显提高正常L6细胞葡萄糖的消耗量和AKT/GSK3β的磷酸化表达,锌与胰岛素共刺激能显著激活AKT/GSK3β;而对于胰岛素抵抗L6细胞,1050μmo/L的锌能明显提高正常L6细胞葡萄糖的消耗量和AKT/GSK3β的磷酸化表达,锌与胰岛素共刺激能显著激活AKT/GSK3β;而对于胰岛素抵抗L6细胞,10⁵0μmo/L锌单独作用可明显提高其葡萄糖消耗量和GSK3β的磷酸化,1050μmo/L锌单独作用可明显提高其葡萄糖消耗量和GSK3β的磷酸化,10⁵0μmo/L锌与胰岛素共刺激能激活AKT的磷酸化表达。结论1050μmo/L锌与胰岛素共刺激能激活AKT的磷酸化表达。结论10⁵0μmol/L的锌可提高L6细胞的葡萄糖消耗量,这种作用可能与其增强AKT和GSK3β磷酸化水平有关。     

原花青素对宫颈癌HeLa细胞Caspase-3和Survivin基因表达的影响

目的 探讨原花青素对官颈癌HeLa细胞Caspase-3和Survivin基因表达的影响.方法 将按照不同终浓度原花青素(0,37.5μmol/L,75.0 μmol/L,150.0μmol/L,300.0μmo/L和600.0 μmol/L)处理宫颈癌HeLa细胞,分别纳入对照组(空白对照),37.5μmol/L PC组,75.0μmol/L PC组,150.0μmol/L PC组,300.0 μmol/L PC组和600.0 μmol/L PC组.继续培养24 h,收集细胞进行实验.采用RT-PCR检测Caspase-3 mRNA和Survivin mRNA表达变化.采取Western blot检测caspase-3和survivin蛋白表达的变化.采用比色法检测caspase-3相对活性.结果 随着原花青索浓度增加,Caspase-3 mRNA和caspase-3蛋白表达水平逐渐增加,而Survivin mRNA和survivin蛋白表达水平逐渐减少;随着处理官颈癌HeLa细胞原花青素浓度升高,caspase-3相对活性逐渐增加,且差异有显著意义(P＜0.05),在原花青素为600.0/μmol/L 时,活性最大.结论 原花青素可剂量依赖性地增加Caspase-3 mRNA和caspase-3蛋白表达水平及caspase-3活性,并且可剂量依赖性减少Survivin mRNA和survivin蛋白表达水平.     

叶酸和维生素A对MNNG致哈萨克族食管上皮DNA甲基化转移酶1高表达细胞信号通路的影响

目的探讨叶酸和维生素A对MNNG诱导的哈族食管上皮DNMT1高表达细胞PI3K/AKT信号通路的影响。方法在1.500×10~(-5)mol/L MNNG转化浓度、不同浓度叶酸(0.800μg/ml和8.000μg/ml)和维生素A(2.500μg/ml)处理不同时间后,采用PCR和Western blot法检测各干预组细胞PI3K/AKT信号通路关键因子表达水平。结果 (1)MNNG半数抑制浓度为23.897×10~(-5)mol/L,转化剂量为1.500×10~(-5)mol/L;(2)经MNNG、叶酸和维生素A作用细胞一定时间后,(1)随着叶酸浓度增加和维生素A作用可使细胞AKT蛋白表达水平逐渐降低,pp2a和PTEN蛋白表达水平逐渐增加,而随着时间延长,细胞PTEN mRNA和AKT蛋白表达水平逐渐增加,pp2a和PTEN蛋白表达水平逐渐降低;(2)对蛋白表达来说,叶酸和维生素A之间存在交互作用。结论叶酸和维生素A对MNNG致哈族食管上皮DNMT1高表达细胞PI3K/AKT信号通路AKT、pp2a和PTEN基因表达具有一定的干预作用。     

镉诱导293细胞凋亡与Caspase-3和p53表达关系

目的研究镉致细胞凋亡过程中Caspase-3和p53表达的变化,探讨Caspase-3和p53基因在镉致细胞凋亡中的作用。方法离体培养的转化人胚肾293细胞以40μmol/L氯化镉分别处理0~24h,N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Caspase-3特异性三肽抑制剂(Z-DEVD-fmk)预处理组分别在镉处理前以5mmol/LNAC和10μmol/LZ-DEVD-fmk预处理24h和1h,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法测Caspase-3和p53水平,流式细胞Anexin-V-PI双染法检测细胞凋亡率。结果40μmol/L镉处理293细胞,6~24hCaspase-3基因mRNA水平显著增高,0~24h内p53基因mRNA无显著变化。40μmol/L镉处理293细胞,6~24h内Caspase-3相对分子质量20000的活性亚单位条带显著增强,与镉处理24h组比较,NAC预处理组Caspase-3相对分子质量20000的活性亚单位条带显著减弱(P<0·01),Z-DEVD-fmk预处理组无明显变化(P>0·05);40μmol/L镉处理293细胞,p53蛋白在6~24h表达增强(P<0·01),与单纯镉处理24h组比较,NAC和Z-DEVD-fmk预处理组p53蛋白表达无显著变化(P>0·05)。结论Caspase-3基因在镉诱导细胞凋亡过程中起着重要的作用。     

六价铬对L-02肝细胞中Caspase-3与Bcl-2表达影响

为探讨六价铬对L-02肝细胞中Caspase-3与Bcl-2表达的影响,将L-02肝细胞暴露于5、10、20 μmol/L重铬酸钾溶液,在Caspase-3特异性抑制剂氟甲基酮(Z-DEVD-FMK)与Bcl-2特异性抑制剂ABT-737存在的条件下分别检测Caspase-3以及Bcl-2 mRNA的表达水平以及Caspase-3的活力.结果显示Cr(Ⅵ)处理激活Caspase-3但抑制Bcl-2;Caspase-3抑制剂缓解了Bcl-2表达的下降,Bcl-2抑制剂使原本已被激活的Caspase-3表达进一步升高.提示本实验剂量的Cr(Ⅵ)可诱导L-02肝细胞发生细胞凋亡,且Bcl-2与Caspase-3之间存在负反馈调节作用.     

双酚A对大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的 研究双酚A (bisphenol A,BPA)对离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及相关凋亡基因表达的影响.方法 将睾丸支持细胞分别暴露于0(溶剂对照)、30、50、70 μmol/L的BPA.采用MTT法检测离体培养细胞活力,采用RT-PCR的方法检测p38 MAPK、caspase-3、FasL、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α) mRNA的相对表达情况,采用western-blotting的方法检测细胞中P38 MAPK、磷酸化P38 MAPK和caspase-3酶原蛋白的表达情况.结果 与溶剂对照组相比,30 μmol/L BPA组支持细胞p38 MAPK mRNA的相对表达量升高,而50 μmol/L BPA组p38 MAPK的表达明显降低(P＜0.05);各浓度BPA染毒组caspase-3mRNA的相对表达量均较高(P＜0.05);仅50 μmol/L BPA组TNF-α mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);50、70 μmol/LBPA组FasL mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);各剂量BPA染毒组总P38MAPK蛋白的相对表达量无显著变化;50和70 μmol/LBPA组磷酸化P38 MAPK蛋白的相对表达量均明显升高(P＜0.05);仅70 μmol/L BPA组caspase-3酶原蛋白的相对表达量下降(P＜0.05).结论 BPA可激活离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞p38 MAPK,并诱发caspase-3活化,导致细胞凋亡,这可能是通过FasL凋亡途径介导的.     

莱菔硫烷对Aβ处理的SH-SY5Y细胞活力、组蛋白乙酰化水平及TrkA表达的影响

目的探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)处理的神经细胞的保护作用及其机制,为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的防治提供理论依据。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用MTT法检测SFN(终浓度为2μmol/L)对Aβ染毒(终浓度分别为10、20、40、80μmol/L)的SH-SY5Y细胞活力的影响,并以Real time PCR、Western blot法分析SFN预处理后的Aβ染毒(终浓度为20μmol/L)细胞TrkA mRNA及其蛋白表达以及组蛋白乙酰化水平(Ace-H3K9、Ace-H4K12)的时相分布变化。结果细胞活力随着Aβ染毒剂量的增加而逐渐降低,其中40、80μmol/L Aβ染毒的细胞活力与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01或P0.001);SFN预处理后的各组细胞活力未见统计学差异(P0.05)。与对照组比较,Aβ处理后12、24 h时,细胞TrkA mRNA水平降低,24 h时TrkA蛋白表达水平降低,6、12、24 h时Ace-H3K9、Ace-H4K12水平降低,差异均有统计学意义(P0.01);与Aβ染毒细胞比较,SFN预处理后的Aβ染毒细胞12、24 h时TrkA mRNA水平升高,24 h时TrkA蛋白表达水平升高,12、24 h时Ace-H3K9以及6、12、24 h时Ace-H4K12水平升高,差异均有统计学意义(P0.001)。结论 Aβ可使细胞活力下降、TrkA mRNA及其蛋白表达水平降低以及Ace-H3K9、Ace-H4K12水平的升高,SFN对Aβ诱导的上述改变均具有抑制作用。     

穿心莲内酯对人宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的研究穿心莲内酯对人宫颈癌Si Ha细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响及潜在机制。方法采用0、20、40和80μmol·L~(-1)的穿心莲内酯处理Si Ha细胞,其中0μmol·L~(-1)的穿心莲内酯组为对照组;通过MTS法检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-3活化率,PI单染法检测细胞周期分布,蛋白免疫印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平。结果与对照组相比,20μmol·L~(-1)穿心莲内酯处理SiHa细胞24 h、48 h、72 h和96 h及40、80μmol·L~(-1)穿心莲内酯处理24 h、48 h、72 h和96 h后的存活率均明显降低(P0. 05);与对照组相比,20、40、80μmol·L~(-1)穿心莲内酯组细胞凋亡率、Caspase-3活化率及G0/G1期细胞比例升高,而活化的β-catenin、Cyclin D1及C-myc表达水平降低(P0. 05)。结论穿心莲内酯具有抑制人宫颈癌SiHa细胞增殖、促进凋亡及细胞周期的阻滞作用,该作用与Wnt/β-catenin信号通路的激活受阻有关。     

双(对氯苯基)二氯乙烯与β-六氯化苯对大鼠睾丸支持细胞凋亡的影响

目的 探讨双(对氯苯基)二氯乙烯[1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene,p,p'-DDE]、β-六氯化苯(β-benzenehexachloride,β-BHC)及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途径的影响及其作用机制.方法 以不同浓度的p,p'-DDE、β-BHC(分别为10、30、50 μmol/L)及其联合(10 μmol/L p,p'-DDE+10 μmol/L β-BHC,30 μmol/L p,p'-DDE+30 μmol/L β-BHC,50 μmoL/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC)处理大鼠睾丸支持细胞24 h,设Caspase-3抑制剂组(先用100 μmol/L Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理支持细胞2 h,再用50 μmol/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC联合处理),采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定支持细胞的活性,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双重荧光染色测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法检测Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA表达量的变化.结果 10、30、50、70 μmol/L p,p'-DDE组吸光度(A值)分别为0.498±0.039、0.481±0.065、0.397±0.032和0.286±0.049,相同浓度β-BHC组A值分别为0.518±0.103、0.490±0.060、0.454±0.054和0.302±0.030,10、30、50 μmol/L p,p'-DDE与β-BHC联合组A值分别为0.483±0.048、0.473±0.058和0.337±0.052,50 μmol/L浓度组与对照组比较,A值降低,差异有统计学意义(t值分别为4.599、2.716、6.537,P＜0.05).AO/EB双重荧光染色分析结果显示,10、30、50 μmol/L各染毒组的支持细胞凋亡率明显升高,与溶剂对照组(9.83±0.95)%、Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO组(15.60±2.74)%比较,p,p'-DDE处理组分别为(23.73±2.24)%、(30.03±2.84)%和(38.04±4.98)%,β-BHC处理组分别为(24.42±3.53)%、(30.64±1.06)%和(39.88±0.17)%,联合处理组分别为(37.08±1.71)%、(42.18±3.32)%和(41.25±3.36)%.逆转录(RT)-PCR结果表明,Caspase-3、Cagpase-8及Caspase-9 mRNA表达量随着p,p'-DDE、β-BHC及其联合浓度的增加而增加.结论 p,p'-DDE、β-BHC及其联合作用可通过激活启动Caspase-8和Caspage-9,进而激活下游效应Caspase-3引起支持细胞凋亡.     

β淀粉样蛋白对人神经母细胞瘤细胞内质网应激的影响

目的研究β淀粉样蛋白(Aβ_(25~35))对人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)凋亡过程中内质网应激的影响,探讨在内质网应激过程中未折叠蛋白质反应途径(UPR pathway)在凋亡中的作用。方法将处于对数生长期的细胞分别暴露于含0(对照)、5、10、20、30、40μmol/L Aβ_(25~35)的培养基染毒48 h,采用CCK8法检测细胞活性。将对数生长期的细胞分别暴露于含0(对照)、5、10、15μmol/L Aβ_(25~35)的培养基染毒24、48和72 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白GRP78以及跨膜蛋白活化转录因子-6(ATF-6)、蛋白激酶-1(IRE1α)和RNA-激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)蛋白的表达水平。结果与对照组比较,各浓度Aβ_(25~35)染毒组SHSY-5Y细胞的存活率均较低,差异均有统计学意义(P0.05);且随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高,SHSY-5Y细胞的存活率呈下降趋势。与对照组比较,各浓度Aβ_(25~35)染毒组SHSY-5Y细胞的凋亡率均较高,除5μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h外,差异均有统计学意义(P0.05);且随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高和染毒时间的延长,SHSY-5Y细胞的凋亡率均呈上升趋势。与对照组相比,各剂量、时间点Aβ_(25~35)染毒组SHSY5Y细胞内质网ATF-6蛋白的表达水平较高;15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24、48 h和各剂量Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞内质网GRP78蛋白的表达水平较高;10、15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h和15μmol/L Aβ_(25~35)染毒48 h及各剂量Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞内质网IRE-1α蛋白的表达水平较高;15μmol/L Aβ_(25~35)染毒24 h和10、15μmol/L Aβ_(25~35)染毒72 h后SHSY5Y细胞质网PERK蛋白的表达水平较高,差异均有统计学意义(P0.05)。随着Aβ_(25~35)染毒浓度的升高和染毒时间的延长,细胞内GRP78、ATF-6、IRE1α和PERK蛋白的表达水平均呈上升趋势。结论 Aβ_(25~35)可以诱导SHSY5Y神经细胞内质网应激,导致SHSY5Y细胞发生凋亡。     

PI3K/Akt信号通路在虾青素调节LX-2细胞活化中作用

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在虾青素调节人肝星状细胞(LX-2细胞)活化中的作用。方法实验设对照组、低、中、高剂量虾青素组(5、10、20μmol/L)、抑制剂组(25μmol/L LY294002)、抑制剂+虾青素组(25μmol/L LY294002+20μmol/L虾青素),作用48 h后检测LX-2细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(col1a1)mRNA表达水平、各组细胞Akt及其磷酸化水平。结果与对照组比较,虾青素组LX-2细胞中α-SMA和col1a1 mRNA表达明显降低,并呈剂量依赖关系(P0.05);与对照组比较,抑制剂组LX-2细胞中磷酸化Akt水平(0.42±0.05)、α-SMA和col1a1 mRNA表达水平[分别为(0.23±0.05)、(0.35±0.06)]均明显降低(P0.05);与对照组比较,虾青素组LX-2细胞中磷酸化Akt水平(0.60±0.07)、α-SM A和col1a1 mRNA表达水平[分别为(0.48±0.07)、(0.61±0.04)]均明显降低(P0.05);与抑制剂组比较,抑制剂+虾青素组LX-2细胞中磷酸化Akt水平(0.18±0.04)、α-SMA和col1a1 mRNA表达水平[分别为(0.11±0.05)、(0.20±0.03)]均明显降低(P0.05)。结论虾青素可通过PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞活化,发挥抗非酒精性脂肪肝纤维化作用。     

TGF-β1-Smad2/3信号转导通路在百草枯中毒致肺纤维化中的作用

目的观察百草枯(PQ)染毒对人肺成纤维细胞的影响,探讨PQ中毒致肺纤维化中转化生长因子β1-Smad2/3蛋白(TGF-β1)-Smad2/3信号转导通路的作用。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以终浓度为0、12.5、25、50、100、200、400μmol/L的PQ处理细胞24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞存活率。使用终浓度50μmol/L PQ处理细胞6、8、12、24、48、72h,检测PQ在不同时间点对细胞的损伤程度。终浓度0、25、50、100μmol/L PQ处理细胞24h,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞TGF-β1蛋白表达水平,聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞TGF-β1 mRNA表达水平。为了观察PQ染毒对TGF-β1/Smad信号通路的影响,将MRC5细胞分成6组:正常对照组、25μmol/L PQ染毒组、50μmol/L PQ染毒组、100μmol/L PQ染毒组、TGF-β1阳性对照组、TGF-β1刺激组(100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1),免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Smad2/3蛋白(p-Smad2/3)表达水平。结果与对照组比较,MRC-5细胞存活率随着PQ剂量和时间的增加明显降低(P0.05),呈剂量和时间依赖性;ELISA显示,PQ作用MRC-5细胞24h后,TGF-β1蛋白表达升高至37.4、48.8、39.3μg/ml,但诱导作用呈非剂量依赖方式;RT-PCR显示,随着PQ浓度增加TGF-β1mRNA表达水平明显升高,分别是对照组的3.5、6.9和9.7倍,诱导作用呈剂量依赖方式(P0.05);Westem blot显示,浓度为25、50、100μmol/L PQ作用细胞24h后,p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平明显升高(P0.05),给予细胞100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1共同刺激下,p-Smad2、p-Smad3蛋白量达到最多(P0.05)。结论TGF-β1、pSmad2、p-Smad3的异常表达参与了PQ致MRC5细胞损伤过程,TGF-β1/Smad信号通路激活在PQ致肺纤维化中发挥重要作用。     

CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响

目的 构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称“L02细胞”),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1 A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定.分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmoL/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA 序列一致.CYP1A2沉默细胞的CYP1A2mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9％和82.4％(P＜0.01).TCE染毒后,0.25 ～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P＜0.01);部分0.25 ～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用.     

PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信号通路在胃癌细胞中的相互作用机制

目的探讨磷脂酰肌醇3–激酶/蛋白激酶B/哺乳动物靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)两条信号通路对胃癌细胞功能的影响及相互作用机制。方法使用PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂AZD8055、MEK抑制剂AZD6244单独或联合作用于胃癌MGC-803细胞。应用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;蛋白印迹法(Western blot)检测通路关键蛋白的表达。结果联合使用LY294002(25μmol/L)与AZD6244(125μmol/L)、AZD8055(0.1μmol/L)与AZD6244(125μmol/L)能够显著抑制胃癌MGC-803细胞的增殖活性,且联用组比单独作用组具有更强的抑制效果(P 0.05);联用组诱导细胞凋亡数量和阻滞于G0/G1期的MGC-803细胞数量增多,高于单独作用组(P 0.05)。与LY294002、AZD8055和AZD6244单独作用相比,LY294002与AZD6244、AZD8055与AZD6244联用组MGC803细胞p-AKT、p-P70S6K和p-ERK1/2蛋白表达明显受到抑制(P 0.05)。结论 PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK两条信号通路在胃癌MGC-803细胞的生长中具有协同调控作用,对于两条信号通路的多靶点抑制能够更加明显的抑制癌细胞生长。     

β-淀粉样蛋白对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株内质网钙库的影响

目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株(PC-12细胞)内质网钙库的影响。方法用已老化的Aβ25-35[浓度分别为0(对照)、10、15、20μmol/L]对经神经生长因子(NGF)处理过的PC-12细胞染毒24、48、72 h。测定PC-12细胞内[Ca2+]i及内质网Ca2+-ATP、IP3m RNA的表达水平。结果与对照组比较,15、20μmol/L Aβ25-35染毒各时间点PC-12细胞内[Ca2+]i均较高,差异均有统计学意义(P0.05);与染毒24 h比较,各剂量Aβ25-35染毒48 h、72 h时PC-12细胞内[Ca2+]i均增高,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,各剂量Aβ25-35染毒各时间点PC-12细胞内质网IP3m RNA表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0.05);与染毒24 h比较,各剂量Aβ25-35染毒48 h、72 h时PC-12细胞IP3m RNA表达水平均增高,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,20μmol/L Aβ25-35染毒24、48 h及各剂量Aβ25-35染毒72 h后PC-12细胞内质网Ca2+-ATP mRNA表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0.05);与染毒24 h比较,20μmol/L Aβ25-35染毒48 h及各剂量Aβ25-35染毒72 h时PC-12细胞内质网Ca2+-ATP mRNA表达水平均升高,差异均有统计学意义(P0.05)。随着Aβ25-35染毒剂量的升高和染毒时间的延长,PC-12细胞内[Ca2+]i及内质网Ca2+-ATP、IP3mRNA的表达水平均呈上升趋势。结论 Aβ具有神经毒性,可抑制PC-12细胞的生长,破坏神经细胞内质网及细胞内钙稳态。     

肾脑表达蛋白过表达载体对于β-淀粉样蛋白诱导神经细胞凋亡的作用机制

目的 探究肾脑表达蛋白(KIBRA)过表达载体对于β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导神经细胞凋亡的作用机制。方法 本研究以原代海马神经细胞为研究对象,利用20μmol/L Aβ25-35诱导,构建体外稳定的AD细胞模型,利用siRNA技术构建KIBRA过表达载体,由慢病毒载体转染AD细胞模型,按照处理方法将AD细胞模型分成3组,即空白对照组、阴性对照组和过表达载体组。利用RT-PCR和Western blot检测KIBRA、Caspase-3以及Caspase-9的表达水平,利用AV-PI试剂盒检测细胞凋亡。结果 AD细胞模型中,可见细胞核汇聚,细胞形态不规则,触角形成。慢病毒滴度的检测结果显示KIBRA慢病毒过表达载体慢病毒转染滴度为7×106TU/ml。空白对照组、阴性对照组和过表达载体组的KIBRA的mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义(F=9. 068,P 0. 05),过表达载体组的KIBRA的mRNA的相对表达量高于空白对照组和阴性对照组(q值分别为2. 021、2. 981,P 0. 05)。过表达载体组的Caspase-3、Caspase-9的mRNA的相对表达量低于空白对照组和阴性对照组(P 0. 05)。Western blot结果与RT-PCR表达趋势相同。AV-PI结果显示,过表达载体组的细胞总凋亡率低于空白对照组和阴性对照组(q值分别为2. 551、3. 003,P 0. 05)。结论 KIBRA的过表达载体可以抑制AD细胞模型的凋亡,可以作为阿尔茨海默病的潜在治疗靶点。     

p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路在多菌灵致小鼠睾丸支持细胞增殖抑制和凋亡中的作用

目的通过建立多菌灵致小鼠睾丸支持细胞(TM4)损伤模型,探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在多菌灵致小鼠TM4细胞增殖抑制和凋亡中的作用。方法将TM4细胞分别暴露于0(对照)、1、2、5、10、20μmol/L多菌灵溶液和10μmol/L SB203580抑制剂溶液及10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵溶液染毒48 h,采用CCK-8法检测细胞存活率。将TM4细胞分别暴露于0(对照)、5μmol/L多菌灵溶液和10μmol/L SB203580抑制剂溶液及10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵溶液染毒48 h,采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞周期,采用Annexin V/PI双标法检测TM4细胞凋亡,采用Western blot法检测细胞P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白的表达水平。结果与对照组比较,5、10、20μmol/L多菌灵组TM4细胞的存活率均下降,差异有统计学意义(P0.01);且随着多菌灵暴露浓度的升高,TM4细胞的存活率呈下降趋势。与5μmol/L多菌灵组比较,10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵组TM4细胞的存活率升高,差异有统计学意义(P0.01);而10μmol/L SB203580抑制剂组TM4细胞的存活率无明显改变。与对照组相比,5μmol/L多菌灵组TM4细胞的凋亡率增加,差异有统计学意义(P0.01);而10μmol/L SB203580抑制剂组的凋亡率无明显改变。与5μmol/L多菌灵组比较,10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵组TM4细胞的凋亡率下降,差异有统计学意义(P0.01)。与对照组比较,5μmol/L多菌灵组TM4细胞G_1/G_0期细胞所占比例降低,而G2/M期和S期细胞所占比例升高,差异均有统计学意义(P0.01);而10μmol/L SB203580抑制剂组各期细胞所占比例均无明显改变。与5μmol/L多菌灵组比较,10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵组TM4细胞仅G_2/M期细胞所占比例下降,差异有统计学意义(P0.01)。与对照组比较,5μmol/L多菌灵组TM4细胞的p-P38 MAPK蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P0.01);而10μmol/L SB203580抑制剂组的p-P38 MAPK蛋白表达水平无明显改变。与5μmol/L多菌灵组比较,10μmol/L SB203580+5μmol/L多菌灵组TM4细胞的p-P38 MAPK蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P0.01)。各组TM4细胞的P38 MAPK蛋白表达水平间比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论多菌灵通过激活p38 MAPK信号通路抑制TM4细胞增殖,并诱导细胞凋亡及周期阻滞,从而造成细胞损伤。     

3β-羟类固醇脱氢酶对邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯处理细胞后诱导型一氧化氮合酶和蛋白激酶C信号通路的影响

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)对MCF-7细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路相关基因及蛋白表达的影响以及3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)基因在此过程中的作用。方法 用浓度为0.00~0.40 mmol/L的DEHP分别染毒MCF-7细胞、3β-HSD沉默细胞和3β-HSD高表达细胞24 h,检测细胞中iNOS/PKC相关基因表达水平的变化;应用信号通路抑制剂处理后再进行DEHP染毒,荧光定量PCR和免疫印迹法检测MCF-7细胞中iNOS/PKC相关基因和凋亡基因表达水平的变化。结果 DEHP染毒MCF-7细胞,iNOS、PKCα在基因和蛋白表达水平均高于对照组;与同一染毒剂量的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中iNOS、PKCα mRNA表达水平降低;而3β-HSD高表达细胞中iNOS、PKCα mRNA表达水平升高。应用iNOS 抑制剂(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)50 μmol/L处理后,DEHP染毒组iNOS、Bax、Caspase-3、Caspase-8表达下调;PKCα抑制剂(chelerythrine chloride,CHE) 0.20 μmol/L处理后,DEHP染毒组PKCα表达下调;而各抑制剂处理组中与对照组比较无明显降低的基因,其变化趋势与未加抑制剂处理的染毒组无显著差异。结论 DEHP引起的毒性作用可能与iNOS/PKC信号通路有关,3β-HSD对iNOS/PKC信号通路相关基因的表达有一定作用。     

苯并(a)芘通过活化蛋白-1非依赖性通路诱导细胞中p53蛋白过表达及高磷酸化

目的探讨苯并(a)芘[B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白、p53磷酸化水平及亚细胞分布和活化蛋白-1(AP-1)活性的改变,以及p53与AP-1的上下游关系。方法转染p53小干扰RNAp53 siRNA质粒(p53-H)、载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)和转染AP-1荧光报告质粒的HELF细胞(AP-H)无血清培养48h后,加入2μmol/L B(a)P作用24h,用Western blot及免疫荧光法检测细胞中p53蛋白及p53磷酸化的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位,用荧光检测法检测AP-1的相对活性。用AP-1的化学抑制剂curcumin抑制其活性,用p53的化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察了二者的上下游关系。结果2μmol/L B(a)P作用24h后细胞内p53蛋白及p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平增加,并且主要分布在细胞核内;AP-1的活性增加。抑制AP-1活性后,对B(a)P诱导的p53蛋白含量增加没有明显的影响;抑制p53表达后,对B(a)P诱导的AP-1活性的增加没有明显影响。结论B(a)P通过AP-1非依赖的信号通路引起人胚肺成纤维细胞p53蛋白含量的增加。     

UVB:辐射对人角质形成细胞HaCaT的DNA损伤及其机制

目的研究不同剂量UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT DNA损伤的影响及机制。方法采用紫外辐照装置照射人角质形成细胞Ha Ca T建立急性紫外辐射细胞模型;MTT法检测不同剂量紫外辐射对细胞存活的影响;免疫荧光和流式细胞术分别检测细胞核内磷酸化γH2AX焦点形成及蛋白表达水平;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测不同剂量不同时间照射后早期细胞凋亡百分数;免疫印迹法分别检测Caspase-3活化水平。结果 UVB辐射可抑制HaCaT细胞的存活,有一定的量效关系;相对较大剂量的UVB辐射可观察到明显的焦点形成;UVB照射后各剂量点磷酸化γH2AX的表达均明显高于未照射的对照组;UVB辐射可通过Caspase-3活化诱导细胞发生早期凋亡,照射后20 h,早期凋亡细胞百分数明显增加,特别是在UVB相对较大剂量范围内更明显,并有随照射剂量增高而增加的趋势。结论 UVB辐射可通过诱导DNA双链断裂抑制人HaCaT细胞存活,并通过激活Caspase-3而诱导细胞凋亡,细胞凋亡延迟,可能导致细胞更易于发生突变进而形成皮肤肿瘤。