石杉碱甲多克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立

目的 制备珍稀药源植物蛇足石杉的活性成分石杉碱甲(huperzine A,HupA)的人工抗原及多克隆抗体,建立快速检测HupA的酶联免疫分析方法.方法 采用戊二醛法,将半抗原HupA与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备人工抗原HupA-BSA和包被抗原HupA-OVA.用HupA-BSA免疫新西兰大白兔,制备抗HupA的抗血清,通过间接ELISA法和竞争ELISA法检测抗血清的效价和特异性.采用Protein A亲和层析法对抗血清进行纯化,以纯化后的多克隆抗体建立HupA的标准竞争抑制曲线.结果 合成的人工抗原HupA-BSA的偶联比为10.8∶1,免疫兔子得到抗HupA的抗血清,其效价为1∶64000,HupA的标准竞争抑制曲线为Y=0.215 1X-0.095 5(R2=0.987 3).结论 成功合成石杉碱甲人工抗原,经过免疫兔子制备抗石杉碱甲的多克隆抗体,建立HupA的酶联免疫检测方法.     

大黄酸人工抗原合成及免疫原性鉴定

大黄药理作用广泛,是临床常用中药材之一.大黄酸是其主要活性成分,大黄酸的含量是大黄质量控制的主要指标之一.目前对大黄酸的检测主要是通过仪器分析手段,如高效液相色谱法,但是仪器分析通常操作繁琐、耗时长、通量小且仪器设备昂贵.与之相比,酶联免疫检测法(ELISA)则具有灵敏度高、操作简单、设备仪器需求少、通量高等优点,是实现中药材快速检测的有效手段之一.该研究制备大黄酸(rhein)人工抗原及血清,为之后大黄酸单克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附检测方法提供基础.通过碳二亚胺法活化大黄酸,分别与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原及包被抗原;通过紫外分光光度法检测人工抗原的半抗原与载体蛋白偶联比,分别为4.0∶1(rhein-BSA)和2.6∶1 (rhein-OVA).用免疫原免疫Bal b/c雌性小鼠,制备抗血清,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗血清效价及特异性.结果表明血清效价均高于8 000,特异性强,免疫原性良好.     

双黄连注射剂中绿原酸致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的:ELISA法检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质绿原酸致敏家兔血清中的特异性抗体效价。方法:取新西兰种家兔,自家兔耳中心动脉采血10ml,制备致敏前血清。将绿原酸与家兔血清体外孵育,制成绿原酸-血浆蛋白完全抗原,将完全抗原皮下注射以免疫动物,1月内共5次。末次注射后7天,麻醉动物,自腹主动脉取血,制备血清,即为绿原酸-血浆蛋白全抗原的抗血清,用ELISA法检测抗血清的抗体效价(OD值);间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体;采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测家兔抗血清中Ig E抗体的含量。结果:绿原酸的抗体效价高于致敏前血清OD值的2倍,说明绿原酸有潜在的致敏性。绿原酸免疫后的家兔抗血清中的抗体具有一定的特异性。经过多次免疫后的家兔体内产生了外源性Ig E型抗体。结论:绿原酸在本实验条件下对家兔有致敏性。     

人参皂苷Rg1人工抗原的合成及免疫原性鉴定

目的 合成人参皂苷Rg1的人工免疫原和包被原,为后续制备人参皂苷Rg1的单克隆抗体及建立相应的免疫分析方法奠定基础.方法 采用NaIO4氧化法分别合成人参皂苷Rg1免疫抗原(Rg1-BSA)和包被抗原(Rg1-PLL);紫外光谱和薄层色谱法鉴定人工抗原偶联是否成功;用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价,用间接竞争ELISA检测抗体特异性.结果 经紫外光谱和薄层色谱法检测,人参皂苷Rg1与BSA/PLL偶联成功;免疫小鼠后Rg1-BSA可以使小鼠体内产生抗Rg1抗体;利用合成的偶联物成功建立间接ELISA和间接竞争ELISA方法,测得小鼠血清抗体效价在1∶80 000以上,并且所得抗体能特异性结合人参皂苷Rg1.结论 成功合成了人参皂苷Rg1人工免疫原和包被原,可用于下一步的人参皂苷Rg1单克隆抗体制备及建立相应免疫分析方法.     

丹酚酸B人工抗原的合成与免疫原性研究

目的制备丹酚酸B（SAB）的人工抗原（SAB-BSA）和包被原（SAB—PLL）并进行鉴定。方法采用碳二亚胺（EDC）法将SAB分别与牛血清白蛋白（BSA）和多聚赖氨酸（PLL）载体偶联合成SAB—BSA和SAB-PLL;采用紫外分光光度（UV）法和薄层色谱（TLC）法对偶联效果进行鉴定,并通过SAB与BSA的吸光值计算出二者的偶联比;利用获得的SAB—BSA免疫小鼠,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体效价并以间接竞争酶联免疫吸附法（ic—ELISA）检测小鼠抗血清内多克隆抗体的灵敏度。结果所合成的SAB—BSA为BSA和SAB的结合物,且SAB-BSA中无游离SAB-SAB与BSA偶联成功,SAB-BSA偶联结合比为18：1;SAB-BSA刺激小鼠产生的针对SAB的多克隆抗体,效价为1：2×10^3,该多克隆抗体IC50为17．7μg／mL。结论SAB—BSA和SAB—PLL合成成功,可用于SAB单克隆抗体的制备以及SAB快速检测试剂盒的研制。     

牡荆素人工抗原的合成与免疫原性的鉴定

目的合成牡荆素的人工抗原,并对其免疫原性进行了鉴定。方法利用高碘酸钠氧化法偶联牡荆素制备牡荆素-牛血清白蛋白的免疫抗原和牡荆素-卵清蛋白的包被原;用紫外分光光度法和薄层色谱法鉴定小分子与载体蛋白偶联反应,并用间接ELISA测定免疫抗原免疫小鼠抗体效价,间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测抗体特异性。结果紫外扫描和薄层色谱结果表明牡荆素与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联成功,小鼠经牡荆素-牛血清白蛋白免疫后,体内产生了抗牡荆素抗体,效价在1∶16 000以上,线性检测范围为0.028 8~18μg/m L。结论合成的牡荆素人工抗原和专属酶联免疫分析法可用于后续的单克隆抗体的制备。     

鲁斯可皂苷元多克隆抗体的制备

目的：通过人工抗原的构建,制备针对鲁斯可皂苷元（ruscogenin,RUS）的特异性抗体,为建立鲁斯可皂苷元的免疫生物分析方法奠定基础。方法：将鲁斯可皂苷元衍生为带有两个-COOH臂的双丁二酸单酯衍生物（succinylated ruscogenin,RUS-2HS）并采用活泼酯法使其与牛血清白蛋白（BSA）相结合,成为全抗原（RUS-2HS-BSA）免疫新西兰兔,制备抗鲁斯可皂苷元的多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测试对抗血清进行鉴定。以同样的蛋白质偶联方法制备鲁斯可皂苷元与卵清蛋白的结合物（RUS-2HS-OVA）作为包被抗原。结果：抗血清的效价为1∶25600,理想的包被抗原浓度为1.563μg·mL^-1,相应抗血清工作浓度为1∶8000。结论：运用活泼酯法可制备鲁斯可皂苷元的人工抗原,进一步免疫可获得抗鲁斯可皂苷元的特异性抗血清。     

双黄连注射剂中黄芩苷致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的酶联免疫吸附法(ELISA)检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质黄芩苷致敏家兔后血清中特异性抗体效价。方法取新西兰种家兔10只,分为空白组、黄芩苷组,每组各5只。自家兔耳缘动脉采血10 m L,制备致敏前血清。将被液相色谱-质谱-血清白蛋白结合系统检测的黄芩苷与家兔血清体外孵育,制成黄芩苷-血浆蛋白完全抗原。将此完全抗原以皮下注射的方式对家兔进行免疫,免疫次数共5次。最后一次免疫结束后,间隔1周时间,将其麻醉,用采血针自家兔腹主动脉采血制备黄芩苷-血浆蛋白全抗原的抗血清。用ELISA法检测抗血清的抗体效价(OD值);间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体;采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测各组家兔抗血清中Ig E抗体的含量。结果黄芩苷的抗体效价(OD)与阴性对照组的(OD)比值2,因此说明黄芩苷具有致敏性。家兔体内产生的抗血清中的抗体具有一定的特异性。家兔体内明显产生了外源性Ig E型抗体。结论黄芩苷对家兔具有致敏性。     

双黄连注射剂中连翘酯苷A致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的 ELISA法检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质连翘酯苷A致敏家兔血清中的特异性抗体效价。方法取新西兰种家兔,自耳中心动脉采血10 m L,制备致敏前血清。将连翘酯苷A与家兔血清体外孵育,制成连翘酯苷A-血浆蛋白完全抗原。将完全抗原皮下注射以免疫动物,1月内共5次。末次注射后7 d,麻醉动物,自腹主动脉取血,制备血清,即为连翘酯苷A-血浆蛋白全抗原的抗血清,用ELISA法检测抗血清的抗体效价(D值)。若1∶128稀释血清的D值大于致敏前血清D值的2倍,即可判定产生了外源性抗体。用间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体,并绘制抑制曲线,以证明其抗体是由连翘酯苷A-血浆蛋白特应性产生的。由于药物引起过敏反应与产生Ig E型抗体有关,因此采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测家兔抗血清中Ig E抗体的含有量。结果抗体效价测定结果表明,连翘酯苷A的抗体效价高于致敏前血清D值的两倍,说明连翘酯苷A有潜在的致敏性。间接竞争ELISA测定抗体特异性结果表明,连翘酯苷A免疫后的家兔抗血清中的抗体具有一定的特异性。Ig E型抗体浓度的测定结果表明,经过多次免疫后的家兔体内产生了外源性Ig E型抗体。结论连翘酯苷A在此实验条件下对家兔有致敏性。     

绿原酸人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

目的 合成绿原酸（chlorogenic acid,CHA）人工抗原,制备CHA多克隆抗体,为制备过敏成分分析的免疫芯片奠定基础。方法 采用碳二亚胺法分别合成CHA免疫抗原（CHA-牛血清白蛋白）和包被抗原（CHA-卵清蛋白）;UV法和TLC法鉴定人工抗原偶联是否成功;间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中抗体效价;间接竞争ELISA方法检测抗体特异性。结果 经UV法和TLC法检测,CHA与BSA偶联成功。血清抗体效价为1∶128 000,CHA-PAbs的质量浓度与抑制率的线性方程为Y＝?0.10 lnX＋1.158,线性检测范围为15.6～250 ng/mL,R²＝0.995,并且和甘草酸、黄芩苷等与其常配伍应用的中药化合物均无交叉反应。结论 成功制备了灵敏度高、特应性好的CHA多克隆抗体,为CHA的微量检测和过敏性研究提供了实验依据。     

双黄连注射剂中黄芩苷抗原合成及抗血清制备分析探讨

目的：对双黄连注射剂中黄芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制备情况进行分析探讨,为今后药物研究工作提供可靠的参考依据。方法：将黄芪苷与牛血清白蛋白采用高碘酸钠法进行交联,鉴定方法为紫外扫描和SDS-PAGE法;经黄芩苷与牛血清白蛋白复合物对新西兰兔进行免疫产生抗血清,采取ELISA法进行检测。结果：经紫外扫描和SDS-PAGE法证实黄芩苷与牛血清白蛋白发生了交联,ELISA法在新西兰兔体内检测出黄芩苷与牛血清白蛋白复合物的抗血清,抗血清效价为1：8000。结论：经高碘酸钠法黄芩苷抗原合成成功,其为黄芩苷单克隆抗体的制备以及ELISA法快速检测黄芩苷提供了可靠的依据,值得关注。     

猪去氧胆酸人工抗原的合成及鉴定

目的 合成并鉴定猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)人工抗原,为进一步制备其特异性抗体,建立相应的免疫分析方法,并为其应用到药理药效的研究中奠定基础.方法 采用混合酸酐法合成HDCA人工抗原(HDCA-牛血清白蛋白),包被原(HDCA-鸡卵清白蛋白);应用硅胶薄层色谱法鉴定人工抗原、包被原合成是否成功;应用人工抗原与弗氏佐剂的乳化液背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠4次后,尾尖取血,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定免疫小鼠抗血清的效价和特异性.结果 薄层色谱法检测结果表明,HDCA与牛血清白蛋白(BSA)偶联成功;小鼠抗血清效价大于1:8 000,竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与HDCA产生特异性结合.抗血清和甘草酸、黄芩苷、栀子苷等与其常配伍应用的中药化合物均无交叉反应,但与胆酸交叉反应率为90%.结论 成功合成了HDCA-BSA,并可诱发小鼠产生相应特异性抗体.为进一步制备抗HDCA单克隆抗体及HDCA药理作用靶点的研究奠定了基础.     

马钱苷人工抗原的合成、鉴定及免疫原性的初步研究

目的首次合成并鉴定马钱苷(loganin)人工抗原,为进一步制备马钱苷单克隆抗体,建立相关免疫分析方法奠定基础。方法采用高碘酸钠氧化法合成马钱苷免疫原(loganin-BSA)和包被原(loganin-OVA);应用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法鉴定马钱苷人工抗原是否偶联成功;通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测免疫小鼠血清中抗马钱苷抗体效价及其特异性。结果经MALDI-TOF-MS检测,马钱苷与BSA偶联成功。竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与马钱苷产生特异性结合,血清抗体效价在1∶40 000。结论成功合成了马钱苷人工抗原,为马钱苷单克隆抗体的制备及其在中药质量评价和动物体内药动学方面的应用奠定了基础。     

木瓜凝乳蛋白酶多克隆抗体的制备及纯化

目的：制备并纯化木瓜凝乳蛋白酶多克降抗体，为建立木瓜凝乳蛋白酶免疫学检测方法打下基础。方法：用自纯化的木瓜凝乳蛋白酶免疫新西兰大耳兔，亲和层析纯化多克隆抗体，并用免疫双扩和ELISA法对其进行鉴定。结果：抗血清效价为1：380000，SDS，PAGE显示纯化后的抗体纯度很高。     

酸枣仁皂苷A人工抗原的制备及鉴定

采用高碘酸钠氧化法首次合成酸枣仁皂苷A(jujuboside A)人工抗原,利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)鉴定酸枣仁皂苷A人工抗原偶联成功,通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫小鼠血清中抗酸枣仁皂苷A抗体效价及其特异性。竞争抑制曲线表明,血清中的抗体可与酸枣仁皂苷A产生特异性结合,血清抗体效价在1∶4 000。成功合成的酸枣仁皂苷A人工抗原,为酸枣仁皂苷A单克隆抗体的制备及研究酸枣仁皂苷A在机体内的药物代谢过程奠定了基础。     

羟基红花黄色素A人工抗原的制备

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)的偶联方法,获得具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原。方法通过偶联物透析液的颜色变化、紫外图谱、红外扫描图谱及动物免疫试验来鉴定制备的人工抗原。结果HSYA-BSA人工抗原在紫外扫描中表现出HSYA和BSA的特征吸收峰;在红外扫描中HSYA-BSA具有HSYA特征官能团的吸收峰和氨基酸的特征吸收峰;间接ELISA检测结果显示产生抗HSYA的特异性抗体,血清效价可达1∶3 200;标准曲线方程计算得BSA和HSYA的结合率是1∶50。结论通过直接偶联法成功制备出具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原。     

芒果苷人工抗原的合成及免疫原性鉴定

目的:合成芒果苷人工抗原并进行免疫原性鉴定。方法:采用经典高碘酸钠法,将芒果苷(mangiferin,MRn)分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)相耦联合成MRn的人工抗原和包被原。用紫外扫描的方法测定其耦联比,并免疫动物,通过间接ELISA方法测定芒果苷抗体的效价,采用间接竞争ELISA(ic ELISA)法鉴定芒果苷人工抗原(MRn-BSA)的免疫原性。结果:MRn-BSA的耦联比为6∶1,ic ELISA实验结果表明,4只人工抗原MRn-BSA免疫的小鼠均有特异性抗体产生,抗体效价:1∶4 000以上,线性检测范围为1~100μg/m L。结论:该方法成功合成了MRn的人工抗原,并且在免疫小鼠的血清中产生了针对MRn的抗体,为下一步芒果苷的单克隆抗体制备以及相应免疫方法的建立奠定基础。     

HBx突变体特异性抗血清的制备及临床研究

目的探讨HBx突变体特异性抗血清的制备及临床效果。方法通过多肽合成的方法制备HBxd431、HBx-d382缺失型突变体特异性多肽抗原,免疫动物制备相应抗血清。产生的抗体经纯化、酶标后,建立检测HBx-d431、HBx-d382特异性多肽抗原及其抗体的ELISA方法。通过对肝细胞癌患者和非肝细胞癌患者临床标本的检测,研究HBx-d431、HBx-d382缺失型突变体多肽抗原及其抗体的临床意义。结果 ELISA法研制的兔抗体HBx-d431、HBx-d382多克隆抗体均能与相应的抗原发生反应,并随着兔抗血清稀释的增加,A值会逐渐下降,肝细胞癌组HBxAg-w、HBxAg-m、HBxAb-w和HBxAb-m明显高于正常健康组,差异有统计学意义。结论建立的ELISA方法将可用于HBV相关肝细胞癌的早期诊断、HBV携带者及慢性乙肝患者的监测。     

紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析

目的 制备红豆杉属植物中抗癌成分紫杉醇(paclitaxel,TAX)的人工抗原及抗血清,为获取分泌抗紫杉醇抗体的单克隆细胞系及分离单链抗体基因、进而以之提高植物中紫杉醇的量,及建立快速检测TAX的酶联免疫吸附测定(ELISA)法提供技术基础.方法 将7-木糖基紫杉醇(7-xylotaxol,7-xyl-TAX)经NalO4氧化打开糖环,与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)反应偶联,制得半抗原-载体蛋白复合物后,用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定其中结合的半抗原数目;以此抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.并通过ELISA法检测其抗体效价和特异性.结果 合成的人工抗原TAX-BSA中TAX与BSA的结合比约为4～5:1;免疫小鼠到特异针对TAX的抗血清,TAX抗体的效价为1:3 200.结论 成功地合成了TAX的人工抗原,且该抗原有较好的免疫原性.     

斯皮诺素人工抗原的合成及免疫原性鉴定北大核心CSCD

采用高碘酸钠法,以BSA,OVA为载体蛋白合成斯皮诺素的免疫抗原和包被抗原,通过紫外扫描法鉴定,偶联率分别为17,13.7。采用间接ELISA和间接竞争ELISA测定小鼠血清,其最高效价达1∶32 000,灵敏度为211.6μg·L-1且交叉反应率低,表明小鼠经斯皮诺素-BSA免疫后可产生高效价、特异性好的抗斯皮诺素抗体。该实验首次成功制备了具有免疫原性的斯皮诺素人工抗原,为进一步制备斯皮诺素的单克隆抗体及建立斯皮诺素的免疫分析方法提供参考。