荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

RT-PCR对青岛市小学生乙型流感病毒Victoria系暴发的检测

目的分析青岛地区乙型流感暴发的流行病学特征,探讨RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的诊断价值,并对疫情控制措施做出评价。方法采集暴发性疫情流感样病例的咽拭子,采用QIAGEN试剂盒提取病毒RNA,RT-PCR方法分别扩增甲型和乙型流感病毒核酸的特异片段,然后,对核酸检测阳性标本采用狗肾传代细胞(MDCK)细胞培养,红细胞凝集抑制试验对培养的病毒进行鉴定和分型。结果采集的18份咽拭子中15份乙型流感病毒核酸检测呈阳性,但甲型流感病毒未检出;15份乙型流感病毒核酸阳性标本经MDCK细胞培养,9份标本发生细胞病变,经鉴定和分型,毒株均属于乙型流感病毒Victoria系。结论 RT-PCR方法对乙型流感病毒暴发的检测具有快速、敏感和高度特异性的特点,WHO推荐的2008-2009年流感疫苗成分中乙型流感病毒株(B/Florida/4/2006)为Yamagata系,而青岛地区暴发的流感为乙型流感病毒Victoria系,提示在今后决定我国疫苗成分时是否应考虑地区流行的特点。     

北京地区2009-2010年乙型流感病毒的流行特征及HA1基因片段特性分析

目的了解2009年5月-2010年4月间北京地区乙型流感的流行特征及血凝素（HA1）变异情况。方法采用real-time RT-PCR法对流感样疑似病人咽拭子进行乙型流感病毒检测,采用DNA Star软件对HA1基因片段核苷酸和氨基酸序列进行系统进化分析。结果 2009年5月-2010年4月共收集并检测流感样疑似病例咽拭子样本2 138份,乙型流感病毒阳性169例,总阳性率为7.9%,且以2010年2月阳性率最高。乙型流感病毒阳性者平均年龄为（35±24）岁,显著高于对照组中的（28±19）岁（P〈0.001）;女性组中乙型流感病毒阳性率为11.8%,显著高于男性组的7.9%（P〈0.015）。HA1片段序列分析显示本地区的乙型流感病毒属于Victoria系,与参考株B/Brisbane/60/2008相比,其核苷酸、氨基酸的同源性分别为93.4%-99.2%和99.3%-99.7%;2个氨基酸发生改变。结论 2009年5月-2010年4月期间北京地区乙型流感病毒的流行高峰为2010年1、2月,主要累及的人群为35岁以上的女性。本地区的优势流行株仍属于Victoria系,其抗原性未发生明显改变,提示以往流感疫苗仍有较好的保护效果。     

吴起县学生群体性发热疫情的快速检测诊断

目的 搞清2006年吴起县学生群体性发热疫情的病原。方法采集了20例发热学生的鼻咽拭子和血液标本，使用美国QUICKVUE流感A＋B快检试剂进行现场检测；在国家级流感监测网络实验室（陕西省疾病预防控制中心），使用美国DHI公司呼吸道病毒抗原七项（甲、乙型流感病毒，副流感病毒1、2、3型，腺病毒，呼吸道合胞病毒）荧光检测试剂盒进行直接荧光抗原检测，用RT—PCR方法进行乙型流感病毒核酸检测。结果对13份鼻拭子标本进行了现场快速抗原检测，其中7份小学生标本显示乙型流感病毒抗原阳性，阳性率为53．85％；对12份鼻咽拭子进行了免疫荧光抗原检测，其中3份呈乙型流感病毒抗原阳性，阳性率为25．00％；对17份鼻咽拭子标本进行了RT—PCR检测，12份显示乙型流感病毒核酸阳性，阳性率为70．59％。结论根据以上实验室快速检测结果，引起此次学生群体发热的病原为乙型流感病毒。     

2021年—2022年宁夏Victoria系乙型流感病毒基因特性分析

目的 了解2021年—2022年宁夏Victoria系乙型流感病毒基因变异情况,为宁夏流感防控提供参考依据。方法 采集流感样病例标本进行核酸检测和病毒分离,对30株Victoria系乙型流感毒株的HA和NA片段进行基因测序,利用生物信息学软件分析进化变异特征。结果 30株宁夏Victoria系乙型流感毒株HA和NA基因在进化上与疫苗株B/Washington/02/2019(2020—2022)亲缘关系较近,属于V1A.3分支。HA基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.5%～99.0%和98.0%～98.6%;NA基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%～99.4%和98.9%～99.6%。与疫苗株B/Washington/02/2019相比,多数毒株在HA区有H122Q、A127T、R133G、G141R、P144L、N150K、G184E、N197D、K203R和R279K突变,涉及3个抗原表位,并在受体结合位点140-loop、190-helix及240-loop处存在突变位点。所有毒株均未发生耐药位点变异。结论 2021年—2022年宁夏Victoria系乙型流感病毒与本年度...     

北京市西城区2009年-2011年乙型流感病毒血凝素HA1基因特性分析

目的:了解2009年10月-2011年9月期间北京市西城区乙型流感病毒的血凝素基因(HA1)的变异情况以及WHO推荐的流感疫苗株对北京地区人群的保护情况。方法:对流感样病例的咽拭子进行病毒分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸提取,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增其HA1基因,用DNAStar生物软件对HA1的序列进行分析处理,并与WHO推荐的疫苗株进行系统进化分析。结果:HA1片段序列分析显示本地区的乙型流感病毒属于Victoria系,与WHO推荐流感2009年-2010年疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,其核苷酸、氨基酸的同源性分别为96.4%～99.1%和98.2%～99.1%。未发现核苷酸的丢失和插入。氨基酸序列中有3个位点发生改变。结论:本地区的优势流行株其抗原性未发生明显改变,提示2010年WHO推荐乙型流感疫苗株对北京地区人群仍有较好的保护效果。     

珠海市2011年连续发生5起乙型流感疫情的病毒HA1基因分析

目的分析珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感毒株HA1基因特性,阐述流感暴发的原因。方法用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒核酸,采用RT-PCR扩增病毒HA基因并测定核苷酸序列,用ClustalX和MEGA4.1分析结果。结果珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感病毒属Victoria系,与2011年流感监测分离株2011C-IN-0056-7相比,没有核苷酸的丢失和插入,没有糖基化位点的改变,核苷酸同源性在97.3%以上,氨基酸有1~3个位点发生了变异,属于同一变异株。与2010-2011年北半球乙型流感疫苗株B/Brisbane/60/2008相比较,核苷酸同源性在98.5%以上,氨基酸有1~4个位点发生变异,也属于同一变异株。结论引起本市流感连续暴发疫情的原因可能是本地流行株抗原漂移所致,与疫苗株B/Brisbane/60/2008核苷酸和氨基酸同源性都很高,吻合性较好,如果能够在儿童中普遍接种,应该能够起到很好的预防作用。     

实时荧光RT—PCR快速检测蚊体内乙型脑炎病毒及福建省基因Ⅰ型乙型脑炎病毒的发现

目的:应用实时荧光RT-PCR方法快速检测蚊体内乙型脑炎病毒,并对蚊体内携带的乙型脑炎病毒进行基因分型。方法:从蚊媒监测点采集蚊标本,研磨后提取RNA,用新型的LNA探针实时荧光RT-PCR方法进行高通量快速筛查蚊体携带的乙型脑炎病毒,对核酸阳性的标本进一步用乙型脑炎病毒E基因特异引物进行RT-PCR扩增和序列测定,根据所测序列与GenBank中不同地理来源乙型脑炎病毒株E基因核苷酸序列分析的结果进行基因型别的判定。结果:12575只蚊子分成254份,用实时荧光RT-PCR方法从来源于福州的2份三带喙库蚊标本中检出乙型脑炎病毒核酸阳性,经RT-PCR及核苷酸序列测定,得到一段长1500nt的E基因核苷酸序列,序列分析结果显示,其核苷酸同源性最大的是来源于上海(DQ404100)和浙江(EU258742)的毒株,分别是99.1%和99.0%,均属于基因Ⅰ型病毒。结论:实时荧光RT-PCR方法是快速检测蚊体内乙型脑炎病毒的理想方法,此次调查发现的乙型脑炎病毒是以往福建省内未见报道的基因Ⅰ型病毒。     

台州市乙型流感病毒分离、鉴定及HA1基因特性研究

目的:了解台州市Yamagata系乙型流感病毒的基因特性、变异情况和WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。方法:用狗肾传代细胞(MDCK)分离流感病毒,用标准血清及荧光定量RT-PCR方法鉴定。选2011年分离株进行HA1基因序列测定,用DNAman和DNAstar生物学软件进行序列分析。结果:2011年分离株HA1基因与参考毒株核苷酸同源性为88.6%～96.9%,氨基酸同源性为89.2%～98.0%,存在8个潜在的糖基化位点,比同谱系疫苗株在197位增加了一个糖基化位点NKT。与Yamagata系代表株在进化树的同一支上,与Victoria系代表株比,氨基酸162位缺失K。结论:本地2011年分离株与近年来WHO推荐的流感疫苗株在HA1片段有明显的氨基酸变异。2010年-2011年台州市主要分离到Yamagata系乙型流感病毒,而WHO推荐使用的2010年-2011年乙型流感疫苗株B/Brisbane/60/2008属于Victoria系,因此本年度流感疫苗对我市乙型流感不能提供最佳的保护性。     

乙型流感病毒NSl基因的进化

NS1蛋白是由流感病毒第8个RNA片段(丙型流感病毒NS1由第7个片段)编码的RNA结合蛋白[1].研究表明,NS1蛋白与流感病毒宿主存在复杂的相互作用[2-5],是流感病毒主要的毒力因子[6].乙型流感病毒是导致流感暴发的主要病原之一,目前为止只发现一个亚型,宿主特异性较强[7].探讨乙型流感病毒NS1蛋白的变异规律,分析其起源和进化过程,对于监控流感病毒感染人群毒力的变化,预测流感病毒流行趋势以及流感减毒活疫苗株的筛选具有重要的参考意义.     

2014 - 2015年盐城地区乙型流感病毒Yamagata系HA1基因变异分析

目的 研究盐城市2014 - 2015年流感监测中分离的乙型Yamagata系流感病毒血凝素HA1区的基因特性,揭示HA1基因的变异与流行的关系。方法 将盐城市2014 - 2015年流感监测哨点医院以及流感暴发点采集的流感样病例标本进行核酸、病毒分离检测,选取2014-2015年各5株乙型Yamagata系毒株,采用一步法RT-PCR方法扩增HA1基因,扩增产物经纯化测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析。结果 抽取的10株乙型流感病毒的HA1基因与WHO 推荐的疫苗株B/Wisconsin/1/2010相比,3个位点氨基酸替换具有普遍性,其中N116K位于抗原决定簇;与B/Massachusetts/2/2012相比,11个位点氨基酸替换具有普遍性,4个位点位于抗原决定簇。绘制的种系发生树显示,B/JSYC/1530/2014与B/Massachusetts/2/2012亲缘关系较近,其他9株与B/Wisconsin/1/2010 亲缘关系较近。 结论 2014 - 2015年盐城地区流行的乙型Yamagata系流感病毒的HA1基因特性正逐渐发生变异,这些变异位点的积累很可能会导致流感病毒发生实质性的抗原性的漂移,加强流感病原学监测工作对及时发现新的流感病毒变异株有重要意义。     

北京地区2005～2006年流感病原监测结果与乙型流感病毒HA1序列分析

目的：分析2005～2006年冬春季北京地区流感病原监测及乙型流感病毒种系分布情况。方法：采用狗肾传代细胞（MDCK）和鸡胚培养分离流感病毒，经血清学试验鉴定分型。选取部分乙型流感提取病毒RNA，经RT—PCR扩增得到HA1基因片段并进行核苷酸序列测定，用信息软件进行种系发生树分析。结果：共采集流感样病例标本1874份，经MDCK细胞分离到510株流感病毒。其中H1N1亚型244株（47．84％）；H3N2亚型57株（11．18％）；B型209株（40．98％），208株为Victoria系，1株为Yamagata系。对210份细胞分离阳性标本进行鸡胚培养，共分离到流感病毒9株，全部为H1N1亚型。28株B型优势流行株与当年疫苗株不属于同一谱系，相差较远；与新预测（2006～2007年）的疫苗株亲缘关系最近。结论：北京地区2005～2006年冬春季节存在H1N1、H3N2、B型3种流感病毒流行，以H1N1、B型为优势毒株。B型Victoria系优势株正在通过变异逐步在流行中占据主导地位。新预测流感疫苗可对人群产生良好的保护效果。     

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。     

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

2006年河北省新分离Victoria系B型流感病毒变异株血凝素基因序列分析

目的分析2006年河北省分离的B型流感毒株HA抗原性和基因特性,阐明HA基因的变异与流感流行的关系。方法用MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞分离培养流感病毒,血凝抑制(Hemasslutination Inhibition,HI)试验鉴定型别。提取病毒核糖核酸(RNA),采用RT-PCR扩增病毒HA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。结果2006年在河北省流行的B型流感病毒属Victoria系,与北半球该流行期的国际疫苗株B/上海/361/02不同,其抗原性与最近的Victoria系代表株B/Hong Kong/330/2001相比已发生较大变异,核苷酸同源性仅为96.5%～97.2%,在抗原决定簇上有6个位点发生了氨基酸替换。结论2006年在河北省流行的Victoria系B型流感病毒是一个新的变种,在HA1区域发生的变异是今年B型流感流行的主要原因,应该引起重视。     

摇床吸附法微量细胞板短期培养快速检测流感病毒

目的：为在流感样疫情的调查中能够快速准确地查清流感病原，提高公共卫生突发性应急事件的快速反应能力。方法：摇床吸附微量细胞板短期培养法的荧光抗体染色用于快速检测流感病毒并与常规的病毒分离方法作比较。结果：对83份流感疑似病人含漱液的快速检测结果与常规的细胞培养法病毒分离结果相比较，在病毒分离阳性的45份标本中，快速检测法也有34份阳性，阳性符合率为75％，敏感性测定达到了能够检测出0．01个血凝单位浓度的流感病毒。结论：微量细胞板荧光染色法检测流感病毒的敏感性要优于一般市售的快速诊断试剂盒。检测时间约在24h内，达到了快速准确的目的。     

2005-2009年大连市流感病毒血凝素基因遗传特性分析

目的分析大连市2005-2009年流感病毒血凝素(HA)基因变异情况。方法采用MDCK细胞分离培养季节流感H1N1亚型28株;H3N2亚型9株;B型(Yamagata系)24株,采用RT-PCR法分节段扩增各毒株血凝素基因,并进一步对各片段进行核苷酸和氨基酸序列测定分析。结果 2005-2009年,大连市分离到的甲型H1N1病毒变异较大,其中2009年分离的一株H1N1亚型毒株A/liaoningxigang/136/2009(H1)与该年WHO推荐的疫苗株相比,抗原决定簇B区上有4个位点发生了突变,属于新的变种。2005、2007年分离的H3N2流感病毒株,与疫苗株相比序列同源性较高,并未发生大的变异;2007-2008年流行的B型Yamagata系病毒与疫苗株B/Shanghai/361/02相比,有7个氨基酸位点发生改变,其中两个位于抗原决定簇,并于196位增加一个糖基化位点。结论各年度WHO推荐的疫苗株与流行株之间匹配性不完全一致,每年由于核苷酸序列的变化而引起了不同程度的抗原性漂移。     

乙型流感病毒分子检测中质量控制的研究

目的 优化乙型流感暴发监测中分子鉴定的实验条件。方法 分别以病毒RNA提取试剂盒手工提取和全自动核酸提取工作站提取江苏省暴发标本RNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测看家基因核糖核酸酶P（RNaseP）和乙型流感核蛋白（B—NP）基因;分别以本实验室建立的RT—PCR扩增体系和进口商品化RT—PCR扩增体系,对乙型流感基质蛋白（B—M）基因进行检测。结果 看家基因RNaseP能有效监测采样和RNA纯化的有效性;手工提取RNA的效率高于自动提取;进口商品化RT—PCR体系的扩增M基因效果较好。结论 以手工法提取RNA,以real—timeRT—PCR检测B—NP基因和以进口商品化RT—PCR扩增体系检测B—M基因,能相对客观地反映病毒流行现状。