Epigenetic and genetic alterations of PTEN in hepatocellular carcinoma

Aim:  To investigate the roles of epigenetic and genetic alterations of the phosphatase and tensin homologue on chromosome 10 gene (PTEN) in carcinogenesis and the development of hepatocellular carcinomas (HCC).
Methods:  A total of 56 cases of HCC tissues and six liver cell lines were studied for the expression of PTEN by immunohistochemistry and Western blot analysis. The PTEN gene mutations in exon5 and exon8 were detected by a combination of single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and DNA sequencing. Methylation-specific PCR (MSP) was used to identify PTEN promoter methylation.
Results:  Of the 56 cases of HCC, 24 (42.9%) expressed the PTEN protein. All surrounding liver tissues of the hepatoma (32 cases) were positive for PTEN. Of the six cell lines, three liver cancer cell lines showed a low expression of PTEN. Five mutations of 56 HCC samples were detected. All of them were located at intron4. No mutation was found in exon5 and exon8. After MSP analysis, we found nine cases of PTEN promoter methylation in 56 specimens (16.1%). However, no CpG island of PTEN was found to be methylated in all six liver cell lines.
Conclusion:  The level of PTEN protein was altered in part of the HCC. The downregulation of PTEN expression may not be mainly associated with the PTEN mutations, but partly due to PTEN promoter methylation and other epigenetic regulation.     

胃癌细胞PTEN基因启动子区甲基化与蛋白表达的关系及意义

目的探讨胃癌细胞中抑癌基因PTEN5’启动子区CpG岛甲基化状态与其蛋白表达的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法检测不同分化程度的胃癌细胞（HGC-27，MGC-803，BGC-823，SGC-7901）中PTEN基因启动子区域甲基化状态。并通过Western blot法检测该4种细胞中PTEN蛋白的表达。结果除SGC-7901外，其他三种胃癌细胞PTEN基因都有不同程度的甲基化，并随着胃癌细胞分化程度的降低。PTEN启动子区甲基化逐渐增强（P〈0．01）；PTEN蛋白表达逐渐减弱（P〈0．01）。PTEN蛋白表达与其启动子区高甲基化之间呈负相关。结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因失活，使其蛋白表达减少甚至缺失，这可能是导致胃癌发生、发展的重要机制之一。     

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶2在肝细胞癌中过表达并介导肝癌细胞中糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白信号传导

目的探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK2)在肝癌组织与正常肝脏组织中的表达差异以及介导肝细胞癌(HCC)细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号传导的相关机制。方法收集配对的HCC及正常组织20对,采用实时荧光定量PCR技术检测SGK2 mRNA表达情况。应用蛋白质印迹法检测人肝癌细胞系Huh-7、SMMC-7721以及正常人肝细胞系L02中SGK2蛋白水平。应用SGK2 siRNA转染人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-7,然后使用蛋白质印迹方法检测上述转染成功细胞系中GSK-3β、β-catenin的蛋白质表达水平。计量资料以均值±标准差(±s)表示,统计学方法采用Student t检验。结果与配对正常肝组织中的表达水平相比,所有20个HCC样品中SGK2 mRNA表达上调。在两种人肝癌细胞系(Huh-7和SMMC-7721)中SGK2蛋白水平显著高于正常人肝细胞系(P<0.01)。在人HCC细胞系SMMC-7721和Huh-7中,SGK2表达下调抑制了未磷酸化GSK-3β表达。另外,在HCC细胞系中SGK2表达下调通过阻止β-catenin蛋白酶体降解来降低β-catenin的去磷酸化。结论SGK2在HCC中过表达并介导HCC细胞中GSK-3β/β-catenin信号传导。     

肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中因纯合性缺失而失表达

目的：检测肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中的基因改变和在mRNA以及蛋白质水平的表达。方法：使用PCR方法检测基因的缺失情况；使用单链构象多态性（SSCP）方法检测基因有无突变；使用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测基因启动子区域的甲基化状态；使用RT－PCR方法检测基因在mRNA水平的表达；使用免疫细胞化学染色和Western blot方法检测基因在蛋白质水平的表达。结果：被检测的6个胰腺腺癌细胞系中，有3个细胞系存在p16基因的纯合性缺失，这3个细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均无p16基因的表达。在全部6个细胞系中没有发现p16基因突变和启动子区域的过甲基化。结论：在被检测的6个胰腺腺癌细胞系中，纯合性缺失是造成p16基因失表达的原因。     

Inhibition of transfected PTEN on human colon cancer

AIM: To study the inhibitory effect of transfected PTEN on LoVo cells. METHODS: Human PTEN cDNA was transferred into LoVo cells via lipofectin and PTEN mRNA levels and its expression were analyzed by Western blot and flow cytometry. Before or after transfection, the effects of 5-Fu on inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis were measured by flow cytometry, DNA bands and MTT. RESULTS: PTEN transfection significantly up-regulated PTEN expression in LoVo cells. 5-Fu inhibited cell proliferation and induced apoptosis in transfected LoVo cells. CONCLUSION: Transfected PTEN can remarkably up-regulate PTEN expression in LoVo cells and promote the apoptosis. PTEN transfection is associated with 5-Fu treatment effect and has a cooperatively cytotoxic effect.     

MicroRNA-21 promotes phosphatase gene and protein kinase B/phosphatidylinositol 3-kinase expression in colorectal cancer

AIM: To explore the regulatory mechanism of the target gene of microRNA-21 (miR-21), phosphatase gene (PTEN), and its downstream proteins, protein kinase B (AKT) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), in colorectal cancer (CRC) cells.METHODS: Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression levels of miR-21 and PTEN in HCT116, HT29, Colo32 and SW480 CRC cell lines. Also, the expression levels of PTEN mRNA and its downstream proteins AKT and PI3K in HCT116 cells after downregulating miR-21 were investigated.RESULTS: Comparing the miR-21 expression in CRC cells, the expression levels of miR-21 were highest in HCT116 cells, and the expression levels of miR-21 were lowest in SW480 cells. In comparing miR-21 and PTEN expression in CRC cells, we found that the protein expression levels of miR-21 and PTEN were inversely correlated (P < 0.05); when miR-21 expression was reduced, mRNA expression levels of PTEN did not significantly change (P > 0.05), but the expression levels of its protein significantly increased (P < 0.05). In comparing the levels of PTEN protein and downstream AKT and PI3K in HCT116 cells after downregulation of miR-21 expression, the levels of AKT and PI3K protein expression significantly decreased (P < 0.05).CONCLUSION: PTEN is one of the direct target genes of miR-21. Thus, phosphatase gene and its downstream AKT and PI3K expression levels can be regulated by regulating the expression levels of miR-21, which in turn regulates the development of CRC.     

抑癌基因PTEN在原发性肝癌中的表达及意义

目的 研究抑癌基因PTEN在原发性肝癌发生过程中的作用及意义。方法 应用免疫组织化学和northern杂交分析60例原发性肝癌及对应癌旁组织中PTEN mRNA及PTEN蛋白表达情况,结合患者的临床病理资料分析PTEN在原发性肝肝癌中的意义。结果 PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞浆内。60例HCC的癌组织中,PTEN蛋白阳性率为48.3％(29/60),明显低于癌旁肝组织的阳性率(100％)。PTEN蛋白在肝癌组织内的表达阳性率与肝癌的病理学分级、有无癌栓有关,PTEN蛋白在肝癌组织的Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级的阳性率分别为84.0％、23.8％、21.4％,无癌栓形成组PTEN蛋白表达的阳性率为55.56%,有癌栓形成组PTEN蛋白表达的阳性率为26.7％。Northern杂交显示,PIEN基因在肝癌细胞内存在四个转录子,其大小分别为5.5、4.4、2.4、1.8 kb。患者肝癌组织内PTEN mRNA的表达水平明显低于对应的癌旁肝组织。PTEN 5.5 kb和4.4 kb的转录子表达水平的降低与血清中AFP水平、有无癌栓、有无卫星灶及病理学分级有关;2.4 kb的转录子表达水平降低与患者有无癌栓、有无卫星灶有关;1.8 kb转录子表达水平的降低与临床病理学指标无关。结论 PTEN在肝癌的发生过程中可能起重要作用,其表达水平有可能作为反映肝癌进展和预后的病理学指标。     

骨桥蛋白基因沉默对肝癌侵袭转移的抑制作用

目的 探讨应用小于扰RNA(siRNA)沉默骨桥蛋白(OPN)基因的表达对人肝癌细胞株侵袭转移的抑制作用. 方法于体外化学合成针对OPN序列特异性的舣链RNA(dsRNA),转染人肝癌细胞株(HCC LM3),用实时定量PCR和Western blot检测OPN mRNA水平和蛋白表达.通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞生物学行为的指标.统计学方法采用SPSS11.5软件进行q检验,计数资料用χ<'2>检验. 结果与空白组相比,siRNA特异性转染HCC-LM3细胞OPN mRNA水平下降84.7%,蛋白水半下降81%(P<0.5);细胞克隆形成数目下降(1.91个对比5.40个,P<0.01);穿过人工基底膜的细胞数减少(13.5个对比33.4个,P<0.05),阴性对照组的OPN mRNA与空白对照组差异无统计学意义(29.7个对比33.4个,P>0.05).结论 沉默OPN基因表达-口J在体外阻遏肝癌侵袭.     

转录因子Foxp3在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究转录因子Foxp3在肝癌细胞中的表达及其对肿瘤免疫微环境的作用。方法用常规RT-PCR和基因表达谱芯片检测Foxp3在10种肝癌细胞系中的表达,进一步用Western blot、免疫组化和流式细胞术验证其蛋白水平的表达;将表达Foxp3的肿瘤细胞及用Foxp3 shRNA沉默后的肿瘤细胞分别与CD4＋CD2-5T细胞共培养,CFSE评价免疫效应细胞增殖情况。结果 Foxp3在所有的肝癌细胞系中均出现表达;肝癌细胞与CD4＋T细胞进行共培养,可显著抑制共培养体系中CD＋4T细胞增殖及其表面标记的表达;肝癌细胞Foxp3表达沉默后,可显著逆转共培养体系中肝癌细胞对CD4＋T细胞增殖的表达抑制。结论在肝细胞癌（HCC）细胞系及部分HCC患者组织中均发现Foxp3的表达,肝癌细胞Foxp3的表达参与对肿瘤微环境中效应性T细胞增殖的抑制。     

骨桥蛋白基因沉默对肝癌侵袭转移的抑制作用

目的 探讨应用小于扰RNA(siRNA)沉默骨桥蛋白(OPN)基因的表达对人肝癌细胞株侵袭转移的抑制作用. 方法于体外化学合成针对OPN序列特异性的舣链RNA(dsRNA),转染人肝癌细胞株(HCC LM3),用实时定量PCR和Western blot检测OPN mRNA水平和蛋白表达.通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞生物学行为的指标.统计学方法采用SPSS11.5软件进行q检验,计数资料用χ<'2>检验. 结果与空白组相比,siRNA特异性转染HCC-LM3细胞OPN mRNA水平下降84.7%,蛋白水半下降81%(P<0.5);细胞克隆形成数目下降(1.91个对比5.40个,P<0.01);穿过人工基底膜的细胞数减少(13.5个对比33.4个,P<0.05),阴性对照组的OPN mRNA与空白对照组差异无统计学意义(29.7个对比33.4个,P>0.05).结论 沉默OPN基因表达-口J在体外阻遏肝癌侵袭.     

骨桥蛋白基因沉默对肝癌侵袭转移的抑制作用

目的 探讨应用小于扰RNA(siRNA)沉默骨桥蛋白(OPN)基因的表达对人肝癌细胞株侵袭转移的抑制作用. 方法于体外化学合成针对OPN序列特异性的舣链RNA(dsRNA),转染人肝癌细胞株(HCC LM3),用实时定量PCR和Western blot检测OPN mRNA水平和蛋白表达.通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞生物学行为的指标.统计学方法采用SPSS11.5软件进行q检验,计数资料用χ<'2>检验. 结果与空白组相比,siRNA特异性转染HCC-LM3细胞OPN mRNA水平下降84.7%,蛋白水半下降81%(P<0.5);细胞克隆形成数目下降(1.91个对比5.40个,P<0.01);穿过人工基底膜的细胞数减少(13.5个对比33.4个,P<0.05),阴性对照组的OPN mRNA与空白对照组差异无统计学意义(29.7个对比33.4个,P>0.05).结论 沉默OPN基因表达-口J在体外阻遏肝癌侵袭.     

骨桥蛋白基因沉默对肝癌侵袭转移的抑制作用

目的 探讨应用小于扰RNA(siRNA)沉默骨桥蛋白(OPN)基因的表达对人肝癌细胞株侵袭转移的抑制作用. 方法于体外化学合成针对OPN序列特异性的舣链RNA(dsRNA),转染人肝癌细胞株(HCC LM3),用实时定量PCR和Western blot检测OPN mRNA水平和蛋白表达.通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞生物学行为的指标.统计学方法采用SPSS11.5软件进行q检验,计数资料用χ<'2>检验. 结果与空白组相比,siRNA特异性转染HCC-LM3细胞OPN mRNA水平下降84.7%,蛋白水半下降81%(P<0.5);细胞克隆形成数目下降(1.91个对比5.40个,P<0.01);穿过人工基底膜的细胞数减少(13.5个对比33.4个,P<0.05),阴性对照组的OPN mRNA与空白对照组差异无统计学意义(29.7个对比33.4个,P>0.05).结论 沉默OPN基因表达-口J在体外阻遏肝癌侵袭.     

骨桥蛋白基因沉默对肝癌侵袭转移的抑制作用

目的 探讨应用小于扰RNA(siRNA)沉默骨桥蛋白(OPN)基因的表达对人肝癌细胞株侵袭转移的抑制作用. 方法于体外化学合成针对OPN序列特异性的舣链RNA(dsRNA),转染人肝癌细胞株(HCC LM3),用实时定量PCR和Western blot检测OPN mRNA水平和蛋白表达.通过生长曲线、克隆形成和Matrigel侵袭实验,观察肝癌细胞生物学行为的指标.统计学方法采用SPSS11.5软件进行q检验,计数资料用χ<'2>检验. 结果与空白组相比,siRNA特异性转染HCC-LM3细胞OPN mRNA水平下降84.7%,蛋白水半下降81%(P<0.5);细胞克隆形成数目下降(1.91个对比5.40个,P<0.01);穿过人工基底膜的细胞数减少(13.5个对比33.4个,P<0.05),阴性对照组的OPN mRNA与空白对照组差异无统计学意义(29.7个对比33.4个,P>0.05).结论 沉默OPN基因表达-口J在体外阻遏肝癌侵袭.