人尿激酶型纤溶酶原激活剂重组腺病毒的构建及其在肝星状细胞中的表达

抑制ＨＳＣ激活和ＥＣＭ合成 ,促进ＥＣＭ降解已成为抗肝纤维化治疗的重要途径。基质金属蛋白酶 (ＭＭＰｓ)是抑制ＥＣＭ在肝脏内沉积的主要蛋白酶。研究证实 ,纤溶酶原由尿激酶型纤溶酶原激活剂 (ｕＰＡ)激活形成纤溶酶后 ,可将以酶原形式分泌的ＭＭＰｓ裂解而激活。此外 ,纤溶酶也可直接降解ＥＣＭ。本实验利用细菌内的同源重组机制构建以ＣＭＶ驱动并同时表达绿色荧光蛋白 (ＧＦＰ)的非分泌型ｕＰＡ复制缺陷型重组腺病毒 (ＡｄｕＰＡ) ,并研究其在ＨＳＣ中的表达和降解胶原的作用 ,为肝纤维化基因治疗研究提供新的手段。设计引物 ,ＰＣＲ获取氨基端以ＲＲ固定信号序列修饰和羧基端经ＫＤＥＬ信号修饰的ｕＰＡｃＤＮＡ片段 ,同时加入ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅢ的限制性酶切位点。通过体外连接构建 ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶ ｕＰＡ穿梭载体 ;酶切线性化后与骨架载体ｐＡｄＥａｓｙ 1电穿孔共转化ＢＪ5 183感受态细菌 ,经同源重组得到重组腺病毒质粒ｐＡｄｕＰＡ ,然后在 2 93细胞内包装得到非分泌型重组腺病毒ＡｄｕＰＡ ;以一定滴度的ＡｄｕＰＡ感染ＨＳＣ ,ＲＴ ＰＣＲ法测定其在ＨＳＣ中的表达 ;同时检测ＭＭＰｓ活性并利用免疫细胞化学技术测定...     

肝细胞生长因子表达载体的构建及在人肝细胞中的表达

１．材料和方法：质粒ＰＢＳ—７由日本大皈医学院 Ｔｏｓｈｉｋａｚｕ Ｎａｋａｍｕｒａ教授惠赠，内部含人类肝细胞生长因子（ＨＧＦ）的ｃＤＮＡ全长片段。真核表达载体ＰＥＧＦＰ—Ｎ３（美国ＣＬＯＮＴＥＣＨ生物技术公司产品），该质粒含绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）序列，在细胞内表达后可发出绿色荧光。首先根据真核表达载体ＰＥＧＦＰ—Ｎ３上的多克隆位点和ＨＧＦ的ＣＤＮＡ质粒酶切位点图谱，选定ＢａｍＨⅠ和 Ｓａ１Ⅰ做双酶切，构建ＨＧＦ的真核细胞表达载体，命名为ＰＥＧＦＰ…     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染表达抑制血管平滑肌细胞迁移

血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣ)内膜下迁移是血管成形术后再狭窄主要成因之一 ,血管紧张素Ⅱ 2型受体 (ＡＴ2Ｒ)可能介导抑制ＶＳＭＣ迁移的作用。本研究用腺病毒介导方法使ＶＳＭＣ转染表达ＡＴ2Ｒ ,并研究ＶＳＭＣ迁移所受到的影响。一、材料与方法1 ＡＴ2ＲｃＤＮＡ的腺病毒载体采用同源重组的方法构建。ＡＴ2ＲｃＤＮＡ(1 0 9ｋｂ)与穿梭质粒载体ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ连接构成重组子ｐＡＣＣＭＶ ＡＴ2Ｒ ,用脂质体介导其与ｐＪＭ17一起转染 2 93细胞 ,进行同源重组产生带有ＡＴ2Ｒ基因的重组腺病毒载体 (ＡｄＣＭＶ ＡＴ2Ｒ) ,用该载体再转…     

携带单纯疱疹病毒tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建(英文)

目的构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体．方法用ＳａｌＩ酶切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧｋｔｋ质粒中用ＢａｍＨＩ酶游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ｐＭＮＰｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７ＺＡＦＰｅ质粒中用ＥｃｏＲＩ酶游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮＰｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰｔｋ逆转录病毒载体．结果酶切鉴定ｐＭＮＰｔｋ和ｐＭＮＡＰｔｋ载体构建正确．结论该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义．     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

人类HLA—B7可诱导启动子调控IRES连接的人TNFα和IFN？…

目的：为增强肿瘤细胞表面ＭＨＣＩ类分子表达，并调动免疫系统更有效地抑制和杀伤肿瘤细胞，构建在ＨＬＡ－Ｂ７启动子调控下，ＩＲＥＳ连接的人ＴＮＦα和ＩＦＮβ基因的重组逆转录病毒载体，方法与结果：将ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ（＋）中，改换酶切位点后定向克隆入含ＨＬＡ－Ｂ７启动子的质粒中，构建成ｐＧＬ３Ｂ７ＴＮＦ。ＩＦＮβｃＤＮＡ经定向插入ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）改换酶切点切下，定向克     

乙型肝炎表面抗原“免疫逃避”突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用乙型肝炎病毒ＤＮＡ开放框架上的ＢａｍＨＩ和ＨｐａＩ位点，酶切消化质粒载体ＰＥｃｏｂ６（含双拷贝ＨＢＶＤＮＡ），得到约９００ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片断。将其插入到噬菌粒载体ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ＋的ＳｍａＩ位点上。然后通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变获得一系列（共１２种）Ｓ基因“免疫逃避”突变型。再通过ＥＢ病毒真核表达载体ｐＭＥＰ４上的ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ位点将噬菌粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｓｋ＋上的Ｓ基因突变型片断定向克隆到ＰＭＥＰ４上，从而构建了含乙肝Ｓ基因突变型的重组质粒ｐＭＥＰ４ＨＢＳＭ。用其转染人肝癌传代细胞系ＨｅｐＧ２，经潮霉素选择，三周后获得抗性细胞克隆。经用抗ＨＢｓ单克隆抗体（含针对ＨＢｓＡｇ“ａ”抗原决定簇）检测除含变异体１４５（即１４５位上甘氨酸为精氨酸替代）外其余抗变异体ＨＢｓＡｇ均为阳性。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实变异体１４５，在分子量约为２３ＫＤ处有一特异ＨＢｓＡｇ蛋白带。     

庚型肝炎病毒NS5基因重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

我们对中国南方株ＨＧＶＮＳＳ部分基因进行分子克隆，并将其插人质粒表达载体ＰＱＥ３０．构建重组表达质粒，在大肠杆菌中进行表达。一、材料与方法１．主要试剂：ＡＭｙ-ＲＴ为Ｐｒｏｍｅｇｓ公司产品，限制性内切酶、Ｋｌｅｎｏｗ酶及Ｔ４ＤＮＡ连接自购自ＢＯｅｈｒｉｌｌｕｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司，质粒ｐＵｃｌ吕与＊ＨＳＱ菌由中山医科大学分子医学中心提供，质粒ＰＱＥ３０与Ｍ１５菌由中国军事医学科学院微生物所提供。２．ＨＧＶＮＳＳ的分子克隆与测序：经计算机分析ＨＧＶ基因编码蛋白质阅读框架及抗原表位，选择ＮＳＳ区抗…     

半随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究

一、材料和方法　　 1.腺伴随病毒 (ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ＡＡＶ)载体的制备 :酪氨酸羟化酶 (ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ,ＴＨ)质粒〔芳香族氨基酸脱羧酶 (ａｒｏｍａｔｉｃａｍｉｎｏ ａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｌａｓｅ ,ＡＡＤＣ)或三磷酸鸟苷环水解酶Ｉ(ＧＴＰｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＩ,ＧＣＨ)质粒〕是ＡＡＶ基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第 1内含子、人源性ＴＨ(ＡＡＤＣ或ＧＣＨ)基因、ＳＶ40多聚腺苷信号的载体质粒。以磷酸钙沉积法共转染载…     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

新近研究表明:幽门螺杆菌(Ｈｐ)的尿素酶Ｂ亚单位(ＵｒｅＢ)、热休克蛋白Ａ亚单位(ＨｓｐＡ)和空泡细胞毒素(ＶａｃＡ)均是有效的抗原成分。由于Ｈｐ属微需氧菌,培养条件要求高,难以获得大量天然来源的ＵｒｅＢ,ＨｓｐＡ,ＶａｃＡ等成分。我们运用ＰＣＲ技术克隆ＨｐｈｓｐＡ基因,并构建载体对其进行序列分析。材料与方法一、材料质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔＴＭＸａ3购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。大肠杆菌ＪＭ109及Ｈｐ菌株系本室保存菌种。ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄⅢ(宝灵曼公司),Ｔ4连接酶,ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ分子量标准(华美生物工程公司)。…     

乙型肝炎病毒x蛋白对肝细胞FasL表达的激活作用

目的探讨ＨＢｘ蛋白对肝细胞Ｆａｓ配基（ＦａｓＬ）表达的调控作用。方法构建ＨＢｘ基因的真核表达载体ｐＣＥＰ４ｘ,电击法转染ＨｅｐＧ２细胞,潮霉素筛选阳性克隆细胞ＨｅＰＧ２Ｘ。用免疫细胞化学染色和免疫蛋白印迹法检测转染ＨＢｘ基因的ＨｅｎＧ２ｘ细胞ＦａｓＬ蛋白的表达。结果逆转录ＰＣＲ祛分析表明,ＨＢｘ基因在转染细胞内可有效转录;ＨｅｐＧ２ｘ细胞出现新的ＦａｓＬ蛋白表达。结论乙肝病毒ｘ蛋白可激活肝细胞表达ＦａｓＬ。     

人工合成恶性疟原虫复合基因在大肠杆菌中的表达及产物的初步鉴定

将人工合成与构建的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，工程菌经ＩＰＴＧ诱导后表达出含外源基因产物与β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白，分子量分别为６５ｋＤａ和７７ｋＤａ。免疫印迹分析显示表达产物可与兔抗恶性疟原虫ＲＥＳＡ多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示融合蛋白中含有恶性疟原虫抗原位点。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

人工合成恶性疟原虫复合基因在大肠杆菌中的表达及…

将人工合成与构建的恶性疟原虫保护性抗原复合原因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，工程菌经ＩＰＴＧ诱导后表达出含外源基因产物与β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白，分子量分别为６５ｋＤａ和ｋＤａ。免疫印迹分显示表达产物可与兔抗恶性疟原虫ＲＥＳＡ多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示融保蛋白中含有恶性疟原虫抗原位点。     

乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆至真核表达载体ｐＶＲ10 12中 ,构建ＨＢＶＸ基因重组表达载体ｐＶＲ10 12 Ｘ。以该质粒转染ＨｅｐＧ2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ)检测细胞Ｘ蛋白的瞬时表达 ,与报告质粒ｐＳＶ ｌａｃＺ共转染ＨｅｐＧ2细胞 ,用试剂盒法检测β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 ｐＶＲ10 12 Ｘ在ＨｅｐＧ2细胞瞬时表达Ｘ蛋白 ,共转染实验中ｐＶＲ10 12 Ｘ组β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3.2倍 ,表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并能够反式激活ＳＶ4 0早期启动子。乙型肝炎病毒X基因在…     

VEGF165核酶对裸鼠人肺腺癌的治疗作用

本研究设计合成针对血管内皮生长因子 165 (ＶＥＧＦ16 5)2 12位点的锤头状核酶及其突变体 ,构建其腺病毒真核表达载体 ,并转染人肺腺癌细胞Ａ5 49,观察核酶对肿瘤细胞生物学特性和ＶＥＧＦ16 5表达的影响及其对肿瘤生长的抑制作用。材料与方法　主要试剂和动物 :胎牛血清、脂质体和ＤＭＥＭ及ＴＲＩｚｏｌＲＮＡ提取试剂 (美国Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,各种工具酶和试剂盒 (美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司 ) ,ＶＥＧＦ16 5单抗和ＣＤ34 单抗(瑞典Ｄａｋｏ公司 ) ,[α 32 Ｐ]ＵＴＰ购自北京亚辉公司 ,裸鼠购自第四军医大学动物中心。质粒 :ｐＧＥＭ3Ｚｆ(…     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因和产毒大肠杆菌纤毛抗原基因的联合表达

目的：编码日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌纤毛抗原Ｋ９９基因的联合表达。方法：ＰＣＲ扩增的Ｋ９９基因克隆入ｐＵＣ１８载体,再将限制性酶切获得的ＧＳＴ基因克隆入ｐＵＣ１８－Ｋ９９重组质粒。限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳选择连接方向正确的重组质粒用于重组蛋白的表达。共表达产物采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ、反向ＩＨＡ、ＥＬＩＳＡ和透视电镜观察进行分析鉴定。结果：共表达产物的分子量约５０ｋＤａ,存在于宿主菌体表面的纤毛中,ＧＳＴ抗血清和Ｋ９９抗血清均可识别共表达产物,提示共表达产物既有ＧＳＴ表位,又有Ｋ９９抗原表位。结论：日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌Ｋ９９基因共表达获得成功。     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

Therapeutic effect of Zijin capsule in liver fibrosis in rats

ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｅｃｔｏｆＺｉｊｉｎｃａｐｓｕｌｅｉｎｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｒａｔｓＣＡＩＤａＹｏｎｇＺＨＡＯＧａｎｇ,ＣＨＥＮＪｉａＣｈｕｎ,ＹＥＧａｎＭｅｉ,ＢＩＮＧＦｅｉＨｏｎｇａｎｄＦＡＮＢｕＷｕＳｕｂｊｅｃｔｈ...