二甲双胍对高糖介导的成骨细胞MG63增殖及相关基因表达的影响

二甲双胍干预高糖环境下成骨细胞MG63,应用CCK-8检测细胞增殖,SFBC速率法检测细胞内碱性磷酸酶活性,RT-PCR法检测细胞相关基因的表达.干预后二甲双胍可促进高糖环境中成骨细胞MG63增殖(P＜0.01);增加碱性磷酸酶活性(P＜0.05);上调Ⅰ型胶原和骨钙素的表达,同时抑制基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-8)的表达(P＜0.05).结果提示二甲双胍可能通过促进成骨细胞增殖、分化和矿化,抑制成骨细胞外胶原基质的降解,发挥对成骨细胞的保护作用.     

罗格列酮对高糖环境下内皮祖细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察高糖环境对内皮祖细胞(EPC)的损伤作用及罗格列酮对其的保护作用.方法 将健康志愿者骨髓单个核细胞接种于包被有人纤维黏连蛋白的培养板中,培养7天后获得正分化的EPC.贴壁细胞随机分为对照组、高糖组和高糖加罗格列酮组,分别于24h、96h后MTT测定3组细胞增殖功能,PI单染法检测其凋亡率.结果 高糖作用24h促进EPC的增殖能力,与对照组比,其OD值更大(P<0.05),且凋亡率没有明显增加(P>0.05).96h后,高糖明显抑制其增殖能力,OD值低于对照组(P<0.05),且凋亡率明显增加(P<0.01).罗格列酮干预后OD值比高糖组明显增加(P<0.05),且凋亡率明显降低(P<0.01).结论 长期高糖作用可抑制EPC增殖功能,使凋亡率增加;罗格列酮可能保护高糖环境下EPC的增殖能力并降低凋亡率.     

不同浓度二甲双胍对子宫内膜癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨二甲双胍对子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法以不同浓度及时间二甲双胍作用Ishikawa细胞,采用四甲基偶氮唑蓝比色法和流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖,并与作用时间浓度相关。流式细胞仪检测提示二甲双胍作用下细胞中G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低。结论二甲双胍能抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,使细胞生长周期停滞。     

二甲双胍对高葡萄糖环境下结肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的观察二甲双胍在高葡萄糖环境下对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭的影响,并探讨其可能的机制。 方法通过Western blot方法检测SW480细胞在高葡萄糖及不同浓度二甲双胍干预后E-cadherin和Vimentin的表达水平,并应用CCK-8法及Transwell侵袭实验检测细胞增殖及侵袭能力的变化。 结果高葡萄糖作用不同时间后均能促进结肠癌细胞增殖,二甲双胍能抑制结肠癌细胞的增殖,并呈时间——剂量依赖性。20 mmol/L浓度二甲双胍干预48 h后,Transwell侵袭实验结果显示细胞穿膜数为（40.18±2.22）%,明显低于高糖组和对照组（F=49.403,P<0.001）;Western blot结果显示E-cadherin表达明显增强,Vimentin表达明显减弱。 结论高葡萄糖环境能促进结肠癌细胞生长,二甲双胍能明显抑制有或无高葡萄糖环境下结肠癌的增殖和侵袭能力,其机制可能与调节上皮——间质转化（EMT）过程有关。     

尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素和骨钙素基因表达的影响

目的　研究尼尔雌醇对人成骨样MG63细胞护骨素 (OPG)、骨钙素 (BGP)基因表达的影响。方法　MG63细胞以不同浓度的尼尔雌醇及雌激素受体纯拮抗剂ICI 182 780分别干预 2 4h、48h及 72h ,用半定量RT PCR法检测OPG、BGPmRNA的表达量。结果　尼尔雌醇可上调MG63细胞OPGmRNA的表达 ,并存在剂量依赖和饱和效应 ,其中以 10 -8mol/L的作用最强。而且OPGmRNA表达有时间依赖性 ,以 48h表达量为最高。尼尔雌醇未显示对MG63细胞BGPmRNA表达的影响。结论　尼尔雌醇上调MG63细胞OPGmRNA表达是其作为抗骨质疏松药物的重要机制。     

罗格列酮对高糖诱导下大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响

以大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)为靶细胞,观察不同浓度不同时间罗格列酮(RSG)对高糖培养的系膜细胞的作用,发现RSG在一定范围内以剂量和时间依赖关系抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖,阻止系膜细胞由G1期进入S期,并诱导细胞凋亡。RSG有效减轻了高糖诱导的肾小球系膜细胞的病理损伤。     

Diphosphonates inhibit human osteoblast secretion and proliferation

In view of the beneficial effect of diphosphonates in Paget's disease and their suppressive effect on alkaline phosphatase, the action of three diphosphonates (aminohydroxypropylidene diphosphonate [APD], clodronate, and didronel) on cultured human osteoblasts in vitro was investigated. All three inhibited basal and 1,25(OH)2 cholecalciferol-stimulated alkaline phosphatase secretion and [3H]thymidine uptake by osteoblasts. It is concluded that diphosphonates consistently inhibit human osteoblasts through a direct action in addition to their known effect on inhibiting bone resorption and that these actions together may form the basis of their beneficial effect in vivo in patients with Paget's disease.     

高糖和泛素蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠肾系膜细胞IκB-α蛋白表达的影响

目的 探讨泛素蛋白酶体途径对高糖刺激的肾系膜细胞IκB-α蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠HBZY-1肾系膜细胞,高糖作为刺激因子,MG132作为干预因素.分别设正常对照组、高糖组(10,20,30mmol/L葡萄糖)、甘露醇组以及MG132加高糖(30mmol/L)组,分别作用12、24、48小时,用Western blot法测各组IκB-α蛋白的表达.结果 (1)与正常对照组比较,高糖作用后IκB-α蛋白的表达呈时间、浓度依赖性下降.(2)与高糖组比较,高糖加入MG132后,IκB-α蛋白的表达下降被明显逆转.结论 高糖可通过泛素蛋白酶体途径促进肾系膜细胞IκB-α蛋白泛素化降解.     

波动性高糖对胰岛β细胞增殖及Skp2-p27表达的影响

目的 探讨波动性高糖对INS-1细胞增殖、凋亡及对细胞周期进程的影响,并研究其可能的分子机制.方法 采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8)检测细胞增殖活性,流式细胞仪测定细胞周期及细胞ROS水平,Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡.应用Western印迹检测细胞周期调控蛋白p27及Skp2的表达水平.结果 (1)波动性高糖及持续性高糖均明显抑制INS-1细胞的生长,且波动性高糖对细胞增殖的抑制作用更为显著.(2)波动性高糖及持续性高糖均明显增加INS-1细胞的凋亡,且波动性高糖作用更为显著.(3)波动性高糖及持续性高糖能明显抑制细胞周期进程,使INS-1细胞周期更多滞留在G0/G1期,G2/M期与S期细胞比例下降,波动性高糖作用更显著.(4)波动性高糖及持续性高糖均能显著增强细胞周期调控蛋白p27的表达,同时减弱Skp2蛋白的表达水平.结论 波动性高糖较持续性高糖更能够抑制INS-1细胞的增殖和诱导凋亡,可能是通过减弱Skp2蛋白的表达水平,增加p27蛋白的活性,使细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞周期进程,从而减弱细胞的增殖活性.

Abstract：

Objective To investigate the effect of intermittent high glucose on proliferation, apoptosis, and cell cycle progression of INS-1 cells, and the possible intracellular pathways activated by intermittent high glucose. Methods Cell viability was evaluated by cell counting kit, the cell cycle was determined by flow cytometry,Annexin-V/PI double-labeled cell apoptosis detection kit was used to monitor cell apoptosis. Cell cycle related protein Skp2 and p27 expressions were detected by Western blot. Results ( 1 ) Both intermittent and constant high glucose significantly inhibited the growth of INS-1 cells, and the former effect was more significant. ( 2 ) Intermittent and constant high glucose levels significantly increased apoptosis in INS-1 cells, and the former effect was more significant. (3) Intermittent and constant high glucose levels significantly inhibited the cell process, the G0/G1 cell cycle arrest also was induced by intermittent high glucose, resulting in lowered proportion of the G2/M phase and S phase of INS-1 cells. (4) Intermittent and constant high glucose significantly decreased the level of protein Skp2 and increased the level of cell cycle related protein p27. Conclusion Intermittent high glucose levels affect INS-1 cell growth and proliferation, as well as induce cell apoptosis, probably by decreasing the level of protein Skp2 and increasing the level of p27 in the cells, resulting in arrest of progression through the G1 phase to the S phase of INS1 cells, and thus impairment of cell proliferation.     

机械应力对MG63成骨样细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察力学刺激对MG63成骨样细胞的结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在这一过程中的作用.方法 应用Western印迹法检测MG63细胞CTGF蛋白表达及细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38磷酸化水平,应用RT-PCR检测CTGF mRNA表达.结果 环状应力刺激可显著上调CFGF蛋白及mRNA表达,3～6 h达高峰,升高2～3倍;并且激活ERK及JNK信号途径,刺激10 min开始活化,ERK在60 min达高峰,而JNK在15～30min达高峰,对p38信号途径没有明显活化作用.JNK信号通路阻断剂SP600125能够阻断应力刺激对CTGF的上调作用,而ERK信号阻断剂PD98059及p38信号阻断剂SB203580却无此作用.结论 环状机械应力通过JNK依赖的途径上调了MG63细胞的CTGF表达.     

高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响

目的 观察不同浓度的葡萄糖对人肾小球系膜细胞增殖的影响及对细胞外基质纤维连接蛋白(Fn),Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响.方法 体外培养人肾小球系膜细胞株,分别加入葡萄糖终浓度为5.5、10、20、30、40 mmol/L进行处理,于不同时间段(12、24、48、72 h)用MTT法检测肾小球系膜细胞的增殖情况,ELISA法检测培养48 h后条件培养基中Fn及ColⅣ的含量.结果 高糖作用12、24、48、72 h均能促进细胞的增殖,且随着葡萄糖浓度升高作用时间的延长促进作用增强.检测细胞上清液的Fn和ColⅣ.与对照组相比,30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后,Fn和ColⅣ表达增高.结论 高浓度葡萄糖对系膜细胞增殖作用具有量效及时效关系,我们选择30 mmol/L浓度的葡萄糖作用48 h为最合适的细胞刺激条件.高浓度葡萄糖可促进系膜细胞细胞外基质的产生,而系膜细胞细胞外基质过度表达,可以直接导致细胞外基质的积聚,从而导致肾小球硬化的发生.     

高胆固醇对成骨细胞MG63增殖的影响

目的探讨胆固醇对成骨细胞MG63增殖的影响及其可能机制。方法体外培养人骨肉瘤细胞(MG63),分别加入0、12.5、25.0、50.0μg/mL的胆固醇,培养24、48、72h,采用MTT方法检测细胞增殖情况;收集细胞裂解液测定细胞碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用qRT-PCR方法测定MG63细胞骨碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型胶原(ColA1)、骨形态发生蛋白-2(BMP2)和核结合因子α1(Cbfα1)的基因表达水平。结果培养于含不同浓度胆固醇溶液培养基中的MG63细胞增殖在各时段均被抑制;胆固醇可致成骨细胞ALP、SOD活性降低,MDA水平增加,增加MG63细胞氧化损伤;胆固醇抑制MG63细胞内BALP、Ⅰ型胶原、BMP2和Cbfα1的基因表达。结论高胆固醇血症增加骨质疏松症发病风险可能与游离胆固醇抑制成骨细胞增殖有关。     

17β-雌二醇对MG63细胞和正常人成骨细胞雌激素受体β表达的上调作用

观察不同浓度17β-雌二醇(17β-E_2)对培养MG63细胞和人成骨样细胞(HOB)雌激素受体β(ERβ)表达的影响,结果显示在MG63细胞ERβ的表达上调与17β-E_2(0～1×10~(-6)mol/L)呈剂量依赖性关系,而在HOB细胞ERβ最大表达的17β-E_2的最适浓度为1×10~(-8)mol/L。     

雌激素膜快速效应对人成骨样细胞MG63 OPG mRNA快速表达水平的影响

目的 探讨17β-雌二醇(E2)膜快速效应对人成骨样细胞MG63的OPG mRNA快速表达水平影响.方法 采用RT-PCR法分析经E2快速作用后的MG63细胞中OPG mRNA的表达水平.结果 E2膜快速效应能诱导人成骨细胞MG63 OPG mRNA表达水平出现一个快速增高现象,其表达高峰时间为E2作用后的10 min左右,而且这一现象能被G蛋白藕联抑制苏拉明所抑制.结论 而E2诱导的人成骨样细胞MG63中OPG mRNA表达水平的快速增高,可能与雌激素启动了雌激素膜受体介导的G蛋白藕联受体调节的磷脂酶C/腺苷酸环化酶通路有关.     

高糖对人大血管细胞钾依赖钠钙交换蛋白6表达的影响

目的 观察钾依赖钠钙交换蛋白6（NCKX6）基因在人主动脉内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的表达，以及高糖对大血管NCKX6表达的影响。方法 Western印迹检测正常血管组织和2型糖尿病血管组织NCKX6蛋白的差异表达，RT—PCR检测NCKX6基因在人主动脉平滑肌细胞（HASMC）、人主动脉内皮细胞（HAEC）和人血管巨噬细胞（THP-1）中的表达，Northern印迹杂交检测高糖作用HAEC细胞NCKX6mRNA的表达差异。结果 Western印迹初步显示NCKX6在2例糖尿病患者大血管中明显高表达，RT—PCR观察到NCKX6基因主要在HAEC细胞中表达，而HAMSC和THP-1细胞中表达量低。Northern印迹杂交进一步观察到随着培养液D-葡萄糖浓度的增加，作用72h后HAEC细胞NCKX6mRNA表达明显增高，30mmol／LD-葡萄糖作用下NCKX6mRNA表达量可增加5—6倍。结论 NCKX6主要在人主动脉内皮细胞中表达，并且受到葡萄糖的调控。提示NCKX6与糖尿病大血管病变有密切的关系。     

二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖与凋亡的影响

目的观察二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖、凋亡的影响,探讨其相关分子机制。方法应用1、2．5、5、10、20、40、60mmol／L二甲双胍处理人胰腺癌CFPAC-1细胞24、48、72h,以未处理的细胞作为对照组。采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测磷酸化AMPK（p-AMPK）、FAS、cyclinD1、Bcl-xl、Bax、caspase-3、survivin蛋白的表达。结果二甲双胍呈浓度及时间依赖性抑制CFPAC-1细胞的增殖。40mmol／L二甲双胍处理细胞48h后,G0／G1细胞比例显著增多[（65．93±0.27）％比（42．89±1．02）％],G2／M期、s期细胞比例显著减少[（22．01±2．95）％比（38．28±4．93）％,（13．58±0．43）％比（20．12±3．38）％],差异均有统计学意义（P值均〈0．05）;细胞凋亡率从对照组的（3．01±0．49）％增加到（32．97±3．19）％（P〈0．05）;p-AMPK、Bax、caspase-3表达增强,FAS、cyclinD1、Bcl-xl、survivin表达减弱。结论二甲双胍可以显著抑制CFPAC-1细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过激活AMPK信号通路,下调FAS、cyclinD1、survivin表达及Bcl-xl／Bax比值,上调caspase-3表达所致。     

IL-6联合sIL-6R对人甲状腺细胞增殖及相关基因表达的影响

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6)联合可溶性IL-6受体(sIL-6R)对人甲状腺细胞增殖及相关基因表达的影响.方法 通过手术标本获得甲状腺组织,采用甲状腺细胞培养技术,提取并培养甲状腺细胞.以不同浓度(0、1、5、10、20 μg/L)的IL-6分别联合sIL-6R 100μg/L干预细胞24、48 h,予以IL-6单克隆抗体进行阻断.以MTT法检测IL-6干预后的细胞活力,并在显微镜下观察细胞形态学变化;以RT-PCR测定IL-6、IL-6受体及糖蛋白130的表达,实时定量PCR检测IL-6干预后甲状腺细胞的钠-碘转运体(NIS)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、促甲状腺激素受体(TSHR)基因的表达.结果 甲状腺细胞表达IL-6、糖蛋白130,但几乎不表达IL-6受体.IL-6联合sIL-6R培养24、48 h后,甲状腺细胞活力显著增加(F=65.28、78.47;P均＜0.05),而使用IL-6单克隆抗体进行阻断,发现随着IL-6单克隆抗体浓度的增加,甲状腺细胞活性亦显著下降(F=60.15,P＜0.05);随着IL-6浓度的增加,甲状腺细胞数量越多,体积越大.IL-6能够抑制NIS、TPO、TG基因的表达(t=6.92～12.12,P均＜0.05),而对TSHR基因无明显影响.结论 IL-6联合sIL-6R能够促进甲状腺细胞增殖,同时也能够抑制甲状腺相关基因的表达.     

二甲双胍及甘精胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨二甲双胍（Met）、甘精胰岛素（Gla）或二者联合对入子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响. 方法 不同浓度Met、Gla或二者联合干预人子宫内膜癌Ishikawa细胞株不同时间.CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡. 结果 与对照1组比较,Met各浓度均可抑制Ishikawa细胞增殖,小剂量（5 mmol/L）可使增殖率下降18.4％.Met可诱导Ishikawa细胞凋亡,高浓度（20mmol/L）晚期凋亡率升高最显著（26.11％）.Gla可促进人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,细胞凋亡率降低.Gla联合不同浓度Met,与同浓度同时间Gla干预对比,可抑制增殖,增加凋亡率. 结论 Met可抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,促进其凋亡,并可阻断Gla对人子宫内膜癌细胞的促增殖作用.     

缬沙坦对高糖刺激下正常人类系膜细胞增殖状况及环氧化酶-2表达的影响

目的 :研究高糖对正常人类系膜细胞 (NHMC)增殖作用及环氧化酶 2 (COX2 )表达状况 ,并观察用血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂缬沙坦干预实验后对系膜细胞增殖的抑制作用和COX2 表达的影响。方法 :将NHMC置高糖状态下进行培养 ,并加缬沙坦进行干预实验。用WST 1法测定NHMC增殖情况 ,并用Westernblot技术 ,分析NHMC的COX2 表达情况。结果 :高糖组NHMC增殖明显高于低糖组。两组间差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。加入缬沙坦 (1.2 5 μmol/L)后 ,无论高糖组还是低糖组NHMC增殖均受到抑制 ,且随着缬沙坦剂量增加细胞增殖抑制递增。各浓度加药与非加药组比较 ,差异有显著性意义 (均P <0 .0 5或P <0 .0 1)。高、低糖组NHMC均有COX2 表达 ,加入缬沙坦后 ,COX2 表达减弱 ,特别是高糖组更为明显。结论 :①高糖能刺激NHMC增殖 ,缬沙坦能抑制NHMC增殖 ,②缬沙坦可降低COX2 在NHMC中表达作用 ,在高糖状态下其作用尤为明显。因此推测缬沙坦对糖尿病肾病的保护作用可能是通过其非动力学作用而实现的     

Metformin reverses the deleterious effects of high glucose on osteoblast function

An association has been previously established between uncompensated diabetes mellitus and the loss of bone mineral density and/or quality. In the present study, we examined the effects of different concentrations of glucose (5.5, 11, 22, and 44 mmol/L) with or without metformin (10–640 μmol/L) on rat primary osteoblasts cultured in an osteogenic medium. With 11 mmol/L glucose, cellular proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, the number of nodules formed, and calcium deposition in mineralized nodules were increased significantly; intracellular reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were slightly reduced, although these reductions were not statistically significant. At higher concentrations of glucose (22 and 44 mmol/L), cellular proliferation, ALP activity, the number of nodules formed, and calcium deposition were greatly reduced; ROS and apoptosis were significantly increased in a dose-dependent manner. Metformin markedly increased cellular proliferation, ALP activity, calcium deposition, and the number of nodules formed and inhibited ROS and apoptosis in all glucose groups. Moreover, we assessed the gene expression levels of Runx2, IGF-1, and IGF-1R. Eleven micromole per liter glucose stimulated Runx2 and IGF-1 expression; 44 mmol/L glucose inhibited Runx2, IGF-1, and IGF-1R expression. Metformin stimulated the expression of Runx2 and IGF-1 in three glucose groups, but it did not affect IGF-1R. In conclusion, our findings suggest that the dual effects of glucose on cell proliferation and development are dose dependent. Metformin not only significantly decreased intracellular ROS and apoptosis, but also had a direct osteogenic effect on osteoblasts at all glucose concentrations, which could be partially mediated via promotion of Runx2 and IGF-1 expression.