逆转录病毒载体介导入凝因子因子Ⅷ的体外高效表达

目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血子因子Ⅷ（ＦⅧ）体外高效表达体系。方法将－Ｂ区缺失（７６０ａａ－１６３９ａａ）的人ＦⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＢＤｃＤＮＡ）克隆至逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建了重组表达载体ｐＬＮＣ－ＦⅧＢＤ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染多种靶细胞。分别采用一期法、ＥＬＩＳＡ法和ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞培养上清中人ＦⅧ的凝血活性（ＦⅧ：Ｃ）和抗原含量（ＦⅧ：Ａｇ）以及细胞中ＦⅧＢＤ ｃＤＮＡ的     

人FⅧ基因高效表达质粒的构建及其在Cos-7细胞中的表达

目的：构建人ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ并观察其在Ｃｏｓ－７细胞中的表达活性。方法：采用缺失大部分Ｂ结构域的人凝血因子ⅧｃＤＮＡ（ＦⅧＤＢ），长度为４．６ｋｂ，将其插入含腺病毒序列表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１，构建了ＦⅧ真核表达质粒——ｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋＦⅧＤＢ，用脂质体介导法将其转染Ｃｏｓ－７细胞，转染后２４，４８，７２小时分别用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＥＬＩＳＡ法及一期法测定培养细胞中ＦⅧＤＢｍＲＮＡ及ＦⅧ的含量与活性。结果：ＲＴ－ＰＣＲ法可检测到ＦⅧＤＢｃＤＮＡ转录的ｍＲＮＡ，ＥＬＩＳＡ法测得７２小时后ＦⅧ的含量为每２４小时１８ｎｇ／１０６细胞，一期法测得活性为每２４小时０．６Ｕ／１０６细胞，相当于正常人血浆中１００μｇ／ＬＦⅧ所产生的凝血活性的６０％。结论：所构建的ＦⅧ真核表达质粒在Ｃｏｓ－７细胞中具有一定的表达活性。     

人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体在NIH3T3细胞中的功能表达

目的　探讨人类粒巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ） 受体（ＧＭＲ） 在ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞中表达的功能特性。方法　将编码人ＧＭＲα和β亚单位的ｃＤＮＡ 转染到无人ＧＭＲ表达的小鼠ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞中,并检测其阳性转染子在配体刺激后的增殖信号传导与酪氨酸磷酸化。结果　重建的功能性ＧＭＲα／β可以介导细胞增殖与细胞集落形成,并诱导βｃ、Ｊａｋ２、Ｓｈｃ 及Ｓｈｃ 相关蛋白Ｐ１４５（ＳＨＩＰ） 酪氨酸磷酸化,然而,人ＧＭＣＳＦ并不能激活仅含ＧＭＲα的ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞出现有丝分裂信号表达。结论　人ＧＭＲα与β亚单位同时转染入ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞后,可通过βｃ 磷酸化,激活Ｊａｋ２ 、Ｓｈｃ 和ＳＨＩＰ信号传导途径,而导致配体依赖性细胞生长与集落形成     

登革病毒E蛋白抗原基因免疫诱导在小鼠免疫应答的初？…

目的：研究登革病毒Ｅ基因免疫的可行性,方法：用脂质体转染法将构建的Ｅ基因重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ导入小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和蛋白质印迹实验检测Ｅ基因的体外表达,然后将重组真核表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＢＬ／ｃ小鼠,检测其诱发特异性体液和细胞应答水平。结果：重组真核表达质粒,ｐｃＤＮＡ３－Ｅ在小鼠体内诱发一一定水平的体液和细胞免疫应答,且持续时间较长,结论：登革病毒     

杯状病毒基因组全长cDNA克隆的构建及感染性病毒RNA的体外转录

目的：构建猫环状病毒（ＦＣＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆,体外转录感染性病毒ＲＮＡ作为研究人及其他杯状病毒的模型或载体。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增覆盖ＦＣＶ全基因组的３个首尾重叠的片段,分步插入到表达性载体中,构建全程ｃＤＮＡ克隆,体外转录ＲＮＡ〉并转染ＣｒａｎｄｅｌｌＲｅｅｓｅ猫肾（ＣＲＦＫ）细胞。结果：构输长ｃＤＮＡ克隆,体外转录并转染ＣＲＦＫ细胞成功,培养上清对ＣＲＦＫ细胞有感染性,使其出现病变     

TCR独特型DNA疫苗诱导抗淋巴系统肿瘤免疫反应的实验研究

本研究观察ＴＣＲ独特型ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠抗肿瘤免疫反应的情况。用ＣＥＭ淋巴瘤细胞系和ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作模型,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＣＥＭ系特异性重排的ＴＣＲ Ｖβ基因,克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中作为ＤＮＡ疫苗。用肌内注射法免疫小鼠,间接免疫荧光法检测小鼠抗体生成和用ＭＴＴ法测定ＣＴＬ活性以检测抗独特型的细胞免疫。结果发现,接种ＤＮＡ疫苗后第４周开始小鼠血清中即可检测到特异性抗独特型抗体     

逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡

目的：探讨逆转录病毒介导的反义ｂｃｌ２序列对细胞凋亡的诱导作用。方法：ＰＡ３１７细胞包装逆转录病毒，病毒转导Ｊｕｒｋａｔ细胞后用ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ｂｃｌ２ｍＲＮＡ及蛋白表达水平；用流式细胞仪计数及ＤＮＡ电泳检测细胞凋亡。结果：转染反义ｂｃｌ２序列可使内源性ＢＣＬ２蛋白表达下降，提高白血病细胞株对足叶乙甙（Ｖｐ１６）的敏感性，促进细胞凋亡。结论：反义ｂｃｌ２序列能促进Ｖｐ１６诱导的白血病细胞凋亡，为ｂｃｌ２反义技术治疗白血病的临床应用提供了实验依据。     

hVEGF165基因转移对血管内皮细胞增殖及分泌功能的实验研究

血管内皮细胞 (ＶＥＣ)损伤是再狭窄的始动因素已为大多数学者所公认 ,因此 ,促进经皮腔内冠脉成形术 (ＰＴＣＡ)后ＶＥＣ的迅速修复并发挥其正常功能是预防再狭窄的关键。实验证明 ,血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)能预防实验性血管成形术后再狭窄[1,2 ] ,但对其机制知之不多。我们观察ＶＥＧＦ对兔主动脉ＶＥＣ增殖及分泌前列环素 (ＰＧＩ2 )和血栓素Ａ2(ＴＸＡ2 )的影响 ,为ＶＥＧＦ用于预防ＰＴＣＡ后再狭窄提供实验依据。材料和方法1　含ｈＶＥＧＦ165ｃＤＮＡ的质粒ｐＳＶＩ2 1由美国Ｂｏｓｔｏｎ大学惠赠 ,腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ·ｐＬ…     

hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ，反式插入方向培养上清没有活性     

应用IRES序列研究人FL与Tpo基因在转染HFCL细胞中的表达

目的　探讨应用内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）序列对逆转录病毒介导的人Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ）与血小板生成素（Ｔｐｏ） 基因在骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ中的表达。方法　利用基因重组技术将ＩＲＥＳ序列与ＦＬ和Ｔｐｏ 基因构建到逆转录病毒载体中,脂质体法将重组质粒ｐＬＦＴＳＮ 和空载体ｐＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７细胞,经Ｇ４１８ 筛选。用抗性克隆培养上清感染ＨＦＣＬ细胞,ＲＴＰＣＲ和基因组ＤＮＡＰＣＲ分析ｍＲＮＡ的表达及基因组整合情况,ＣＦＵＧＭ 集落法和Ｔｐｏ 依赖株法测定生物学活性。结果　成功构建出含ＩＲＥＳ序列的ＦＬ与Ｔｐｏ 基因逆转录病毒载体,ｍＲＮＡ水平及基因组中整合有ＦＬ与Ｔｐｏ 基因,生物学活性测定表明转染的骨髓基质细胞同时分泌ＦＬ与Ｔｐｏ。结论　ＩＲＥＳ序列调控ＦＬ与Ｔｐｏ 双基因在骨髓基质细胞中同时独立表达,为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响奠定了基础。     

聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导人凝血因子Ⅷ的体外高效稳定表达

目的 应用纳米材料聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物／逆病毒基础的质粒载体复合体，在表达水平、持续时间和细胞毒性三方面进行血友病A基因治疗的体外研究。方法 PAMAM树枝状聚合物与含B区缺失(760aa～1639aa)人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)的以逆病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅦBD形成复合体后，转染NIH3T3细胞系，于转染后第2，5，10，15，30d留取细胞培养上清，分别采用一期法和ELISA法检测其中人FⅧ的凝血活性(FⅧ：C)和抗原含量(FⅧ：Ag)，并应用RTPCR方法检测细胞中FⅧBD cDNA的转录，以细胞生长抑制率来表示PAMAM的细胞毒性。结果 PAMAM载体介导的人FⅧ的体外表达可持续30d，24h内每ml细胞上清中10^6细胞表达FⅧ：C平均为0．929U，FⅧ：Ag平均为0．188μg，期间FⅧ表达未见降低；PAMAM的细胞生长抑制率为5．32％。结论 PAMAM能够有效介导逆病毒基础的质粒载体pLNC-FⅧBD转染靶细胞，并维持高效稳定表达，且PAMAM的细胞毒性较低。     

D-氨基酸氧化酶基因在K562细胞中的表达及其介导的细胞毒性作用的研究

目的探讨逆转录病毒介导的红色酵母D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因在K562细胞中的表达及其功能.方法将DAAO cDNA克隆至逆转录病毒载体pLSN中,构建了载体pLDAAOSN,经ΦNXA细胞包装后,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,以重组逆转录病毒感染K562白血病细胞,G418筛选出抗性克隆,命名为KDAAO.PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达,并以不同浓度的D-丙氨酸(D-Ala)处理KDAAO细胞.结果重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因.包装细胞产生了高滴度病毒(5.2×106 cfu/ml).DAAO基因已整合至KDAAO细胞基因组中,并在mRNA水平表达.D-Ala能明显杀伤KDAAO细胞.结论 DAAO/D-Ala自杀基因系统可以进一步用于肿瘤的基因治疗研究.     

小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选

本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒，观察其对Qa-1基因的沉默作用，筛选出有效靶位。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具，选择3段针对Qa-1的siRNA，交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒，采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞，第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒，第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照，收集转染后24、48、72小时的细胞，用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa—1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析，筛选最有效的干扰片段。结果表明：成功构建了3个针对小鼠Qa—1的小发夹表达质粒。RT—PCR及流式细胞术检测证实，转染后3个组shRNA载体均可抑制Qa-1基因的表达，但抑制程度不一：24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231：60．9％，81．9％，43．6％；H2-T232为：64．5％。73．9％。61．1％；H2-T233为：61．9％，71．2％，47．5％．其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显。结论：构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达，其中H2-T232具有最有效抑制作用。     

B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。     

重组逆转录病毒pLNCX2-TH的构建及鉴定

目的：构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLNCX2-TH,建立稳定的PT67产病毒细胞系,并观察其对NIH3T3细胞的感染效率,为基因调控干细胞分化治疗帕金森病奠定基础。方法：采用基因工程技术,将酪氨酸羟化酶（TH）基因片段克隆至逆转录病毒载体pLNCX2-MCS上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行病毒包装、扩增,最后通过感染NIH3T3细胞,测定病毒滴度。结果：酶切、测序结果与TH基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1.6×106pfu/mL,对NIH3T3细胞有较高的感染效率。结论：应用基因工程技术可成功构建重组逆转录病毒pLNCX2-TH,建立PT67产病毒细胞系,为帕金森病的基因治疗创造了条件。     

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

慢病毒介导的B区缺失的人凝血因子Ⅷ在NOD/SCID小鼠中的持续表达(英文)

近年来,基因治疗作为一种新的治疗方法给血友病A的治疗提供了新的思路。本研究旨在探讨在体外和NOD/SCID小鼠中应用慢病毒载体介导的血友病A基因疗法的可能性。构建含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因和IRES-eGFP编码序列的慢病毒表达载体pXZ9/BDDFⅧ。通过3质粒共转染293FT包装细胞,包装后感染293FT,HLF,Chang-liver和人骨髓间充质干细胞。在感染后分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA),一期法,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)法检测凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性,FⅧ抗原,FⅧ的mRNA转录和基因整合情况。超速离心收集病毒颗粒,并通过门静脉注射感染NOD/SCID小鼠。ELISA分析小鼠血浆FⅧ抗原,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,转导后1个月RT-PCR分析小鼠肝脏人FⅧ的转录情况。结果表明:成功制备高浓度的重组慢病毒,并能在体外高效转导靶细胞。感染后72 h能检测到高水平的FⅧ活性和FⅧ抗原。RT-PCR和PCR法能敏感检测到人FⅧ基因转录和整合至感染后的细胞中。在所有接受重组慢病毒颗粒注射后的NOD/SCID小鼠肝脏中均能检测到人FⅧ基因的转录,同时重组慢病毒也能在体内高效转导小鼠肝细胞。在感染后72 h小鼠血浆中人FⅧ水平为(49±6)mU,1周后为(54±8)mU,1个月后为(23±4)mU。结论:携带BDDhFⅧ基因的慢病毒颗粒在体内外能高效转导靶细胞,且所有被转导的靶细胞都能有效的分泌人FⅧ。经过门静脉注射慢病毒颗粒的NOD/SCID小鼠可以持续表达人FⅧ。