靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建***

背景：有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。 目的：构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。 方法：根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。 结果与结论：构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P < 0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。关键词：血管内皮生长因子;微小RNA;肝癌;肝细胞;抑制;基因表达;组织工程 缩略语注释：VEGF: vascular endothelialcell growth factor,血管内皮生长因子 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.017     

体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成

背景：胶质瘤的根除治疗至今仍是一大难题,抗血管生成治疗胶质瘤有望成为新的有效途径。目的：证实内皮抑素在体外对血管生长的抑制作用,为今后利用其抑制肿瘤生长奠定实验室基础。方法：取Wistar大鼠肝脏,提取mRNA后利用RT-PCR获取内皮抑素cDNA片段。碱裂解法小量提取质粒pcDNA3。重组质粒pcDNA3-Endo的构建。重组pcDNA3-Endo真核表达载体转染骨髓间充质干细胞。RT-PCR及Western Blot检测内皮抑素基因的表达。MTT法检测ECV-304细胞增殖抑制实验。体外实验共分成4个组：重组质粒组、空载质粒组、脂质体对照组及空白对照组。结果与结论：成功构建pcDNA3-Endo重组真核表达质粒,pcDNA3-Endo质粒能在体外有效转录并分泌内皮抑素基因,转染了外源pcDNA3-Endo质粒的ECV-304细胞增殖明显受到抑制。结果提示内皮抑素基因能在体外有效抑制血管内皮细胞的增殖。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

VEGF165反义RNA对人食管鳞癌细胞影响的实验研究

目的 :观察血管内皮生长因子16 5 (VEGF16 5 )反义RNA对人食管鳞癌细胞EC10 9的影响 ,探讨其治疗食管癌的可行性。方法 :采用亚克隆技术 ,构建并鉴定VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体。以重组质粒转染人食管鳞癌细胞EC10 9后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,分别利用原位杂交、激光共聚焦、图象分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后EC10 9细胞的生物学性状和致瘤性。结果 :成功地构建了VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体 ,并在EC10 9细胞中获得表达。转染细胞中VEGF16 5 的表达下降 75% ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和和瘤组织中血管的生成明显下降。VEGF16 5 反义RNA转染组、空载体转染组和对照组中肿瘤的体积 ,分别为 (82 0± 112 .5)mm3 、(793 0± 10 3 5)mm3 和 (7850± 950 )mm3(P <0 .0 1) ;微血管的密度分别为 (8.5± 1.2 ) /mm2 、(44.3± 9.4) /mm2 和 (46.4± 12 .6) /mm2 (P <0 .0 1)。结论 :VEGF16 5反义RNA能够明显减少食管鳞癌细胞内VEGF16 5 的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,可望用于实体肿瘤的辅助治疗。     

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。     

缺氧反应元件启动子表达反义血管内皮生长因子(VEGF)165 cDNA靶向性抑制骨肉瘤细胞VEGF表达

目的以缺氧诱导因子-1/缺氧反应元件(HIF-1/HRE)基因调节系统为载体,构建含HRE启动子的人反义血管内皮生长因子(VEGF)165 cDNA真核表达载体,探讨其对缺氧条件下骨肉瘤细胞VEGF表达的靶向性抑制作用.方法采用聚合酶链反应(PCR)和DNA重组技术构建由HRE启动子驱动的含荧光素酶(Luc)报告基因和人反义VEGF165 cDNA全长的真核表达质粒,将其转染骨肉瘤细胞系MG63,用液闪计数仪测定缺氧对报告基因表达的调节,酶链免疫吸附试验(ELISA)法检测缺氧条件下细胞VEGF表达的变化.结果成功构建了由HRE启动子驱动的含Luc和反义VEGF165 cDNA全长的真核表达质粒pBI-HRE-Luc-AsVEGF165,该质粒转染骨肉瘤细胞系,缺氧条件下可使报告基因在肿瘤细胞中的表达提高3.5×102倍,使肿瘤细胞VEGF分泌下降45%.结论利用肿瘤缺氧,HRE启动子能够实现反义VEGF165的高效表达,为开展靶向性抗肿瘤血管生成治疗提供了实验依据.     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

内皮抑素及其在肿瘤治疗中的应用研究进展

内皮抑素是一种内源性血管生成抑制因子,其能通过多种作用机制抑制血管内皮细胞迁移而抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的生长,除此之外内皮抑素与放疗、化疗相结合效果显著,同时内皮抑素作为肿瘤的标志物,在利用特殊的给药系统进行治疗的研究上也有了突破性的进展.重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)大大的提高内皮抑素的抗肿瘤作用,现已进入Ⅲ期临床研究,利用定点诱变技术得到的小分子内皮抑素不仅抑癌效果显著,并且纯化容易,可以低成本大量生产,为肿瘤的治疗提供了广阔的前景.本文就内皮抑素的结构特征、作用机制、在肿瘤治疗中的应用进展作一综述.     

小干扰RNA靶向血管内皮生长因子基因抑制胆囊癌细胞的增殖体内外实验

背景:已有研究发现RNA干扰可通过抑制血管内皮生长因子基因表达抑制肿瘤细胞增殖,但目前关于应用RNA干扰胆囊癌血管内皮生长表达的研究国内外尚无相关报道。目的:构建并筛选靶向血管内皮生长因子的shRNA,观察RNA干扰血管内皮生长因子的效果及对胆囊癌细胞增殖的影响。方法:设计VEGF-shRNA片段,连接到pCYU6/GFP/Neo-shRNA质粒载体上。shRNA转染胆囊癌细胞。建立裸鼠胆囊癌模型,随机分成空白组、阴性对照组、实验组(干扰pShRNA-VEGF2),每组6只。瘤内注射shRNA。荧光显微镜观察细胞生长状态,半定量反转录-聚合酶链反应法与实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰效果,观察胆囊癌裸鼠模型肿瘤体积变化。结果与结论:RNA干扰血管内皮生长因子后,胆囊癌细胞细胞变圆,皱缩,部分细胞死亡脱落。shRNA片段血管内皮生长因子2、血管内皮生长因子1均可抑制VEGF mRNA表达,抑制率可达86%,82%。裸鼠肿瘤模型中实验组肿瘤与对照组、阴性组相比明显变小,且生长缓慢(P0.05),而对照组和阴性组在肿瘤大小及生长趋势上没有明显的差别。实验构建的hVEGF-shRNA质粒表达载体通过抑制血管内皮生长因子的表达,抑制胆囊癌细胞增殖,从而达到间接治疗肿瘤的目的。     

人内皮抑素在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

目的:表达人内皮抑素蛋白,制备多克隆抗体,检测其生物学活性。方法:采用PCR法扩增人内皮抑素基因,构建pGEX-ES融合表达载体,IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达。初步纯化的内皮抑素包含体蛋白制备兔多克隆抗体,Western-blot检测其在小鼠肝、肾等的表达。亲和纯化的内皮抑素蛋白用内皮细胞抑制实验检测其生物学活性。结果:诱导表达的人内皮抑素蛋白经凝血酶酶切后,分子量约为 20kD,具有抑制内皮细胞生长的活性。制备的多克隆抗体检测出内皮抑素在小鼠肝、肾等组织的表达。结论:人内皮抑素的成功表达及抗体制备为抗血管生成治疗实体瘤的研究及检测奠定实验基础.     

肿瘤抑素41肽重组表达及活性研究

目的：构建肿瘤抑素41肽重组质粒,使其高效表达并纯化得到41肽,研究其抗肿瘤活性。方法人工设计并合成肿瘤抑素41肽基因序列,克隆到表达载体 pTYB21上,转化到大肠埃希菌 BL?21（DE3）中, IPTG诱导融合蛋白高效表达,几丁质亲和层析柱纯化后经Tricine?SDS?PAGE鉴定41肽。利用MTT法、吖啶橙／溴化乙锭（ AO／EB）荧光染色、小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理切片来研究肿瘤抑素41肽的生物学活性。结果构建肿瘤抑素41肽重组质粒,获得可溶性肿瘤抑素41肽。体外实验显示,41肽具有抑制人脐静脉内皮 HUVEC 细胞、人胃癌 HGC?27细胞和人肝癌HepG2细胞增殖和促进HUVEC、 HGC?27细胞凋亡的作用。体内实验显示,41肽对小鼠H22腹水型转移肝癌实体瘤生长具有明显的抑制作用,抑瘤率达到34?35％。结论成功构建了pTYB21?41肽重组质粒,肿瘤抑素41肽具有显著的抗肿瘤活性,为肿瘤抑素机制研究和临床应用研究奠定了基础。     

肿瘤抑素抗血管活性相关肽的表达及活性研究

目的利用大肠杆菌表达系统表达肿瘤抑素抗血管活性相关肽-21肽,检测其生物学活性。方法人工合成21肽基因序列(肿瘤抑素75～95位氨基酸),克隆到表达载体pTYB2上,转化大肠杆菌BL-21(DE_3),酶切和测序鉴定后,用IPTG诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化21肽。通过MTT实验,细胞生长曲线测定,小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验及组织病理学切片研究其活性。结果获得的可溶性21肽对人脐静脉内皮细胞的生长具有抑制作用。小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验抑瘤率达42.86%。组织病理学切片结果可见H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少。结论经初步检测获得具有抗血管活性的21肽,为进一步研究肿瘤抑素的作用机制和肿瘤的临床治疗奠定了基础。     

靶向性抗癌蛋白色素上皮衍生因子在肿瘤中的研究进展

在肿瘤靶向治疗研究中,抗血管生成治疗是近十年来的一个研究热点.目前已有许多血管生成抑制剂应用于临床试验中.色素上皮衍生因子(PEDF)是一个能有效抑制新生血管形成的蛋白,与血管内皮生长因子(VEGF)等共同调控新生血管的发生过程.PEDF表达和抑制肿瘤生长、减少转移、良好的预后相关,对PEDF的深入研究有助于发挥其在肿瘤治疗中的作用.     

三阴性乳腺癌模型裸鼠血管正常化后对紫杉醇的反应

目的:通过观察人三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)模型裸鼠血管正常化后对紫杉醇的反应,探讨重组人内皮抑素与紫杉醇在血管正常化时间窗内联用是否优于紫杉醇单用并分析磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)在早期评估化疗的作用。方法:将人TNBC细胞株MDA-MB-231种植于36只BALB/c-nu雌性裸小鼠的右下腹部皮下,随机分成4组(模型组、重组人内皮抑素治疗组、紫杉醇治疗组及人内皮抑素联用紫杉醇治疗组),每组有7只完成实验。重组人内皮抑素于实验开始时给药,连续使用17 d,紫杉醇于实验第6天和第12天分别给药,所有用药均为腹腔注射,用量均为10 mg·kg~(-1)·d~(-1)。治疗前1 d及注射实验试剂后5、11、17 d进行MRI扫描,所有荷瘤鼠均在最后一次MRI扫描后颈椎脱位处死,切下瘤体,进行病理学及免疫组化检测,测定肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)及Ki67表达。结果:第17天,联用组移植瘤体积小于模型组及重组人内皮抑素治疗组(P0.05),但与紫杉醇治疗组比较无显著差异。第11天,紫杉醇治疗组的慢弥散系数大于模型组,联用组慢弥散系数大于重组人内皮抑素治疗组(P0.05)。解剖各组荷瘤鼠未见远处转移病灶。HE染色显示4组肿瘤外周均有明显坏死,且药物治疗组坏死程度均高于模型组。药物治疗组的MVD均小于模型组,且药物联用组均小于药物单用组(P0.05)。药物联用组Ki67表达较重组人内皮抑素组明显降低,但与紫杉醇治疗组相比无显著差异。结论:在血管正常化时间窗内,重组人内皮抑素联合紫杉醇化疗对TNBC移植瘤虽有明显的抑瘤作用,但疗效未优于紫杉醇;慢弥散系数可以早期预测治疗效果。     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

血管内皮抑素的临床应用进展(文献综述)

内皮抑素(endostatin,ES)是一种能特异性作用于内皮细胞,并能抑制血管生成的内源性血管生长调节因子.自1997年美国哈佛大学O'Reilly从鼠血管内皮细胞瘤株的培养液中分离出内皮抑素,经纯化和氨基酸测序后,发现它是胶原蛋白的ⅩⅤⅢ的一个片段,并证实它是一种潜在的内源性抗血管新生因子.经多个实验证实,ES能有效抑制多达60种以上不同种类肿瘤,并能调节12%的人类基因组表达,从而下调病理性血管发生而没有毒副作用,也无耐药性,是迄今发现的最好的血管生成抑制因子之一[1].现将ES在临床上的研究和应用进展简要综述如下.     

四元复合体介导C-MYC反义RNA抑制肝癌细胞生长增殖

目的探讨四元复合体介导的C-MYC反义RNA转移系统对肝癌细胞系HepG2.2.15致瘤性的体内外抑制作用。方法C-MYC反义RNA四元复合体体外瞬时转染HepG2.2.15细胞,流式细胞术检测C-MYC蛋白的表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化,MTT法测定细胞增殖代谢活性。以HepG2.2.15细胞制备荷瘤裸鼠模型,局部瘤内注射C-MYC反义RNA四元复合体或联合注射IFN-α,称量瘤重,免疫组化方法检测肿瘤组织C-MYC蛋白的表达。结果C-MYC反义RNA可显著降低细胞C-MYC蛋白的表达水平,使细胞生长停滞于G0/G1期。体内抑瘤实验显示,反义治疗组瘤体C-MYC蛋白表达降低,瘤重(1.72±0.16)g,显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。联合IFN-α注射组抑瘤效果更佳。结论肿瘤组织靶向性C-MYC反义RNA转移系统在体内外均可有效降低C-MYC蛋白的表达,抑制细胞的生长增殖。体内联合IFN-α可取得更佳的抑瘤效果。     

肿瘤抑素30肽的重组表达及抗肿瘤活性研究

目的：重组表达肿瘤抑素30肽并研究其抗肿瘤活性。方法设计并合成30肽基因序列,将此序列与融合蛋白表达载体 PTYB21重组,转化到大肠埃希菌 BL-21(DE3)。 IPTG 诱导表达,几丁质柱纯化得到30肽,经 SDS-PAGE 及 Tricine-SDS-PAGE 对纯化产物进行鉴定。利用 MTT 法、吖啶橙/溴化乙锭(AO/ EB)荧光染色法、小鼠 H22腹水转移型肝癌实体瘤抑瘤实验,研究30肽的抗肿瘤活性。结果成功重组并表达肿瘤抑素30肽。体外实验显示,30肽具有抑制 HGC-27胃癌细胞、 HUVEC 人脐静脉细胞增殖和促进这两种细胞凋亡的作用。体内实验显示,30肽对小鼠 H22腹水型肝癌抑瘤率达43.18 ％ 。结论重组的肿瘤抑素30肽具有较强的抗肿瘤活性。     

CDK1靶向shRNA质粒载体的构建及鉴定

目的:设计并构建CDKI -shRNA质粒表达载体,转染肝癌HepG2细胞,验证shRNA对肝癌HepG2细胞CDK1基因的沉默效应,便于进一步研究CDK1的功能.方法:设计针对CDK1 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体片段进行连接、转化.经测序等方法鉴定重组克隆.将重组载体质粒经脂质体包裹转染肝癌HePG2细胞,realtime PCR及Western blot检测RNA干扰效果.结果:重组克隆经测序证实插入的序列正确,realtime PCR及Western blot检测证实设计的3条RNA干扰序列有效沉默了肝癌HepG2细胞中的内源性CDKI.结论:所制备的CDK1-shRNA在肝癌HepG2细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CDK1为靶向的shRNA能够有效下调CDK1基因的表达,对周期依赖激酶CDK1功能的研究奠定基础.     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

内皮抑素对HepG-2细胞生长的影响及机制研究

目的探讨内皮抑素对人肝癌细胞株HepG-2细胞生长增殖和血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响及其可能的机制，为临床肝癌治疗中内皮抑素的应用提供实验依据。方法采用MTT法检测不同浓度的内皮抑素作用不同时间后对HepG-2细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测内皮抑素对细胞凋亡及周期分布的影响；免疫组织化学法检测内皮抑素作用前后HepG-2细胞中survivin蛋白表达的改变；Western blotting法检测加药前后HepG-2细胞中VEGF蛋白表达的变化。结果内皮抑素能抑制HepG-2细胞的生长增殖（P〈0．05），呈剂量-时间依赖性，并诱导细胞凋亡；免疫组织化学结果显示，内皮抑素作用后HepG-2细胞中survivin蛋白表达明显减少，差异具有显著性（P〈0．01）；Westernblotting结果显示药物作用组中VEGF蛋白表达明显减少，差异具有显著性（P〈0．01）。结论内皮抑素通过下调survivin蛋白的表达诱导HepG-2细胞的凋亡、抑制增殖，并能明显降低HepG-2细胞中VEGF的表达。