二脱氧肌苷对背根神经节神经元突起生长的影响

目的探讨二脱氧肌苷（didanosine, ddI）对分散培养的胎鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元胞体和突起生长的影响。方法分散培养的胎鼠DRG神经元用不同浓度的ddI (1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL) 孵育,对分散培养的DRG神经元用微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2, MAP2）免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM）观察神经元胞体和突起的改变。结果分散培养的胎鼠DRG神经元用ddI孵育3d后,神经元突起的数目减少和长度变短,而神经元的胞体的大小则没有明显变化。结论ddI可直接影响分散培养的胎鼠DRG神经元突起的生长。     

胰岛素样生长因子 1对背根神经节神经元谷氨酸损伤的保护作用

目的探测胰岛素样生长因子 1（IGF 1）对背根神经节（DRG）神经元谷氨酸（Glu）损伤的保护作用。方法Wistar胎鼠DRG神经元分散培养48?h后,用Glu（200?μmol/L）造成神经元损伤,并同时给予IGF 1（10?nmol/L）,观察添加IGF 1和未添加IGF 1孵育的Glu损伤的神经元的活细胞生长状况,并用流式细胞仪检测神经元的凋亡率,用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测细胞内钙离子荧光强度。结果用IGF 1孵育的神经元生长状况良好,凋亡率、细胞内钙离子荧光强度均低于无IGF 1孵育的标本。结论IGF 1可通过减低钙离子内流,抑制细胞凋亡,从而对Glu损伤的DRG神经元产生保护作用。     

辣椒素对背根神经节神经元钙离子浓度和线粒体膜电位的影响

目的探讨辣椒素对体外原代培养的胎鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）和线粒体膜电位（mitochondiral membrane potential，MMP）的影响作用。方法分散培养的胎鼠DRG神经元用不同浓度的辣椒素（0.001μmol/L, 0.01μmol/L, 0.1μmol/L, 1μmol/L, 10μmol/L）孵育1min，用共聚焦激光扫描显微镜检测神经元［［Ca²⁺］_i的改变。对于能引起［Ca²⁺］_i升高的浓度组，在辣椒素孵育1min时，用流式细胞术检测神经元MMP的变化；并且在移去辣椒素后10min，重新检测神经元［Ca²⁺］_i的变化。结果0.001μmol/L、0.01μmol/L辣椒素孵育1min，神经元胞内［［Ca²⁺］_i没有变化；0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L辣椒素孵育1min，神经元胞内［Ca²⁺］_i升高，移去辣椒素后10min，0.1μmol/L、1μmol/L辣椒素孵育的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i恢复到基础水平，10μmol/L辣椒素孵育的标本升高的［Ca²⁺］_i没有明显改变。辣椒素孵育时用无钙溶液，则神经元胞内［Ca²⁺］_i不升高。10?μmol/L辣椒素孵育1min的DRG神经元MMP降低，0.1μmol/L和1μmol/L辣椒素孵育的标本MMP无明显变化。结论一定浓度的辣椒素可使原代培养的DRG神经元胞内［Ca²⁺］_i升高，MMP降低。低浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内可以恢复到基础水平，而高浓度辣椒素引起的［Ca²⁺］_i的升高在10min内则不能恢复。辣椒素所致的胞内［Ca²⁺］_i升高可能是由于胞外钙离子内流引起的。     

联合培养中心肌细胞诱导结状神经节神经元的迁移及P物质的表达

目的：探测联合培养中心肌细胞对迷走神经结状神经节神经元的迁移和P物质表达的影响作用。方法：建立Wistar大鼠结状神经节与心肌细胞联合培养的模型,用倒置相差显微镜观察结状神经节与心肌细胞培养不同时间的活细胞生长状况。联合培养72、96h,用Holmes还原银染色法观察神经元的迁移,用免疫组织化学法观察P物质的表达。结果：联合培养72、96h,与单纯培养的结状神经节组织块相比,结状神经节与心肌细胞联合培养的标本中神经元迁出的数目明显增多（P＜0.05）。结状神经节与心肌细胞联合培养96h,探测到了P物质免疫反应阳性神经元和神经纤维。而在单纯结状神经节组织块培养72、96h以及结状神经节与心肌细胞联合培养72h的标本中,均没有探测到P物质的表达。结论：联合培养中心肌细胞可诱导神经元的迁移和神经递质P物质的表达。神经元在形态学上的发育成熟可能需要72h就可以完成,而在联合培养中神经递质合成的发育成熟则需要96h。神经元在形态学上的发育成熟并不能代表神经递质合成的发育就已经完成。这一结果对于进一步研究心肌细胞的选择性神经支配以及神经与心肌的相互作用开辟了一条新的研究途径。     

人参皂苷Rb1对胎鼠背根神经节损伤的保护作用

目的观察不同浓度人参皂苷Rb1对损伤胎鼠背根神经节（DRG）神经元形态学改变的影响,探讨人参皂苷Rb1对谷氨酸引起的兴奋性神经毒损伤的保护作用,为Rb1的进一步研究和临床应用提供理论依据。方法选择胎龄为15 d的SD大鼠,获取DRG神经元并进行体外分散培养48 h后,随机分为对照组、谷氨酸损伤组、谷氨酸损伤＋低浓度Rb1（10μg/ml）保护组和谷氨酸损伤＋高浓度Rb1（100μg/ml）保护组,继续培养12 h。终止培养后,倒置相差显微镜观察各组神经元的生长状态,MTT检测不同浓度人参皂苷Rb1孵育的背根神经节神经元的凋亡增殖情况。结果对照组DRG神经元细胞贴壁呈单层散在分布,少部分出现细胞聚集现象,突起较长且互相交织形成网状;谷氨酸损伤组DRG神经元细胞聚集现象明显,神经元突起变短、断裂甚至消失;谷氨酸损伤＋Rb1保护组DRG神经元细胞部分呈簇状聚集,部分呈单个散在分布,突起仍然相互交织。MTT结果显示谷氨酸损伤＋Rb1保护组细胞存活率均高于谷氨酸损伤组,但高浓度Rb1保护组与低浓度Rb1保护组之间差异无统计学意义。结论人参皂苷Rb1可以影响损伤胎鼠DRG神经元的形态学改变和凋亡增殖情况,对胎鼠背根神经节神经元具有一定的保护作用。     

壳寡糖促神经元生长的作用

目的研究壳寡糖（COSs）对大鼠神经元生长的影响。方法以体外培养的背根神经节（DRG）和DRG神经元为研究模型,通过神经丝蛋白-H（NF—H）免疫荧光细胞化学染色和LeicaQWin软件检测不同浓度壳寡糖（0．0、0．1、0．2mg／m1）作用5d对DRG和DRG神经元突起生长的影响;通过Westernblot检测不同浓度壳寡糖（0．05、0．1、0．2mg／m1）作用DRG神经元12h后,对DRG神经元中NF—H和生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的影响。结果与对照组相比,中、高剂量壳寡糖（0．1、0．2mg／m1）显著促进DRG突起的生长（均P〈0．01）;0．2mg／ml剂量的壳寡糖明显促进DRG神经元突起的生长（P〈0．05）。与对照组相比,体外培养的DRG神经元加入壳寡糖作用12h后,0．2mg／ml剂量壳寡糖组的NF—H和GAP43表达量明显增加（分别P〈0．05和〈0．01）。结论壳寡糖可有促进体外培养的DRG和DRG神经元突起的生长,并可促进NF—H、GAP43的表达。     

不同浓度GDNF诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化研究

目的观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元分化的影响。方法取新生鼠脑组织体外分离培养NSCs,第2代NSCs诱导培养基中分别加入0、5、10、20 ng/mL GDNF进行诱导。用逆转录-聚合酶链反应检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定NSCs,检测NSCs向DA能神经元分化率。结果各诱导组均表达TH mRNA。神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原。与空白对照组比较,GDNF诱导组TH阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且10、20ng/mL GDNF诱导组升高幅度明显高于5 ng/mL GDNF诱导组(P<0.05),10、20 ng/mL GDNF诱导组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论从新生鼠脑组织分离出NSCs。不同浓度的GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,GDNF浓度从10ng/mL提高到20 ng/mL时TH阳性细胞率无明显变化。     

芍药苷对大鼠背根神经元细胞内Ca2+的影响

摘要：目的：建立一种评价中药活性成分对大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞内游离Ca2 浓度影响的方法。方法：显微解剖获取大鼠背根神经节，通过胰蛋白酶消化，过筛，用DF-12和抗有丝分裂培养液交替培养纯化，获得原代大鼠DRG神经元细胞，并采用细胞免疫荧光技术测定DRG神经元细胞纯度；采用激光共聚焦显微成像技术（LSCM），观察细胞内Ca2 荧光强度的变化，并对Ca2 荧光强度变化率进行分析，探讨芍药苷对DRG细胞内游离钙离子浓度及辣椒素受体的影响。结果：采用上述方法分离得到的DRG细胞纯度可高达95%以上，辣椒平可通过阻断辣椒素激活的瞬时受体电位通道（TRPV1）的作用而抑制细胞内Ca2 的增加。芍药苷表现出与CAP类似的作用，可以阻断细胞外Ca2 内流。结论：芍药苷可能是通过作用于TRPV1通道，而抑制DRG细胞内Ca2 大量增加，本方法可以用于评价药物对大鼠DRG细胞内Ca2 浓度的影响。     

HIVgp120对胎鼠背根神经节神经元突起生长的影响

探讨人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）gp120对体外培养的背根神经节神经元胞体和突起生长的影响。方法：分散培养的胎鼠背根神经节神经元用不同浓度的HIV gp120 (125、250、500?pmol/L和1?nmol/L) 处理,对分散培养的背根神经节神经元用MAP2免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜观察神经元胞体和突起的改变。结果：应用gp120后7?d,神经元突起的数目减少,长度变短,而神经元的胞体则没有明显变化。结论：HIV gp120可直接影响分散培养的背根神经节神经元突起的生长。     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

胶质源性神经营养因子对损伤的培养大鼠背根神经节的作用

目的　应用体外培养海人藻酸 (KA)兴奋性毒素损伤的细胞模型 ,研究 GDNF对损伤的背根节神经元的不同作用 ,为进一步研究 GDNF对神经元作用机制 ,表达产生及检测方法提供思路 .方法　采用原代培养的方法 ,用 N1无血清分离培养背根节神经元 ,再用 5μm ol· L- 1 KA作用 6～ 8h ,加上含有 GDNF的无血清培养基 ,继续培养 2 4h,然后用MTT法检测反映细胞的活性 ,胎盘蓝染色记数、细胞总蛋白测定以及形态学观察突起的生长状况 .结果　 1细胞活性 A值 :GDNF+KA(0 .0 32 8± 0 .0 0 6 ) ,KA(0 .0 2 85± 0 .0 0 75 ) ,GDNF (0 .0 398± 0 .0 0 2 ) ,Blank(0 .0 41± 0 .0 0 2 ) (P<0 .0 5 ) ;2活细胞数相应为 GDNF+KA (6 0± 4.4) ,KA(35 .7±2 .2 ) ,GDNF (5 9.3± 3.6 ) ,Blank (5 7.7± 2 .9) ;3细胞的总蛋白分别为 GDNF+KA (70 .3± 9.2 ) (P<0 .0 1) ,KA (49.0± 3.7) ,GDNF (75 .0± 7.3) ,Blank (6 8.0± 5 .5 ) (P<0 .0 1) ;4突起长度 :实验组与对照组不明显 ,GDNF组与空白对照组不明显 .结论　在正常无血清体外培养情况下 GDNF对DRG神经元作用不明显 ,在 KA兴奋性毒素损伤后 ,对细胞的活性、存活及总蛋白合成有明显的保护作用 ,但对突起的生长则没有明显的促进作用 .     

不同浓度的GDNF对运动神经元诱向生长作用的研究

目的探讨不同浓度的胶质源性神经营养因子（GDNF）对运动神经元的诱向生长作用。方法应用运动神经元体外诱向生长模型,将不同浓度的GDNF置于该模型中形成稳定的浓度梯度,72h细胞培养后,通过测量模型中运动神经元生长锥的诱向生长的角度及神经元芽突的长度来初步筛选对运动神经元诱向作用最佳的GDNF浓度。结果GDNF200ng／mL组与GDNF100ng／mL组间无明显区别（P〉0．05）：GDNF200ng／mL组及GDNF100ng／mL纽与空白对照组及GDNF50ng／mL组间比较,前两组均明显优于后两组,差异均具有统计学意义（P〈O．05）;空白对照组与GDNF50ng／mL组间差异明显（P〈0．05）。结论GDNF对运动神经元有明显的诱向生长作用,研究中初步确立了体外GDNF对运动神经元细胞诱向作用的最佳浓度为100ng／mL。     

一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法

目的建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠背根神经节（D0rsal root ganglion,DRG）细胞培养方法。方法分离并培养成年大鼠DRG神经元,显微镜下观察培养神经元的形态,膜片钳技术记录培养神经元的基本膜电生理特性及ATP激活电流。结果培养的DRG神经元形态结构完整;其静息膜电位在正常范围内,可记录到诱发动作电位及钠电流;在膜片钳全细胞记录模式下,能稳定地记录到ATP诱发电流。结论培养的成年大鼠DRG神经元适合膜片钳试验。     

部分背根切断对备用背根节GDNF、FGF-2表达的影响

目的 探讨部分背根切断后不同时相备用背根节(DRG)中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞神经生长因子(FGF-2)的表达变化。方法 15只猫分正常组、单侧部分背根切断7d及14d组,每组5只。分别于术后7d、14d处死动物,取正常组一侧、模型组手术侧L6DRG,用兔抗GDNF、FGF-2抗体行免疫组化ABC法染色,计数DRG内两因子阳性总细胞及阳性大、中小细胞的数量。结果 GDNF在正常猫DRG大、中小细胞均有分布;去部分背根后,两时相备用DRG GDNF阳性神经元总数均有下降且呈进行性递减。DRG阳性中小细胞数亦为术后两时相进行性下降,DRG阳性大神经元术后两时相均较正常组显著减少,但术后14d与术后7d组无显著性差异。FGF-2在脊髓DRG大、中小细胞亦有分布;去部分背根后7d,FGF-2阳性神经元总数下降,14d时又恢复至正常,中小细胞亦表现为先减少后上升的趋势,而大细胞则术后两时相与正常组间无显著差异。结论 去部分背根手术可致备用DRG中GDNF阳性神经元总数进行性下降,FGF-2表现为术后7d下降,14d时恢复。