玻璃化技术冷冻人类囊胚和单胚胎移植

玻璃化冷冻技术简化了胚胎冷冻程序,提高了各个阶段胚胎的冷冻保存效果,尤其是对程序化冷冻效果差的囊胚的冷冻保存,是最具有前景的胚胎冷冻方法。囊胚移植和单胚胎移植被认为是提高种植率、降低多胎妊娠率的有效方法。本文就玻璃化冷冻的影响因素和囊胚玻璃化冷冻进展综述如下。     

玻璃化冻融小鼠囊胚的超微结构观察

目的观察冻融小鼠囊胚的超微结构改变情况,研究冷冻对囊胚的冷冻损伤。方法采用6组玻璃化溶液对小鼠囊胚进行冷冻保存,复苏后通过透射电镜观察超微结构改变情况。结果各组小鼠囊胚均表现相似的超微结构损伤:线粒体肿胀、粗面内质网脱颗粒、高尔基复合体扩张、含有絮状物或膜性结构的小泡增多、微丝结晶的出现、细胞间紧密连接和桥粒减少。结论冷冻对于小鼠囊胚的冷冻损伤主要是细胞膜性结构和细胞骨架系统的损伤。     

冻融周期单囊胚移植的影响因素

人类辅助生殖技术的最终目的是让不孕不育夫妇获得一个健康的孩子。多胎妊娠被认为是一种并发症,而不是成功的助孕结果。如何有效避免双胎妊娠同时维持总体妊娠率一直是辅助生殖治疗中面临的重要挑战之一。选择性单囊胚移植是即能降低多胎率又能有效维持总体临床妊娠率的有效手段。胚胎冷冻保存作为人类辅助生殖技术不可缺少的一部分,在增加移植机会、提高每个取卵周期的累积妊娠率、减少卵巢过度刺激等方面起着重要作用。然而,目前关于冻融周期如何降低多胎率的报道甚少,许多问题有待深入研究。     

玻璃化冷冻囊胚复苏移植与新鲜胚胎移植的围产期状况比较

目的比较体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗中玻璃化冷冻囊胚复苏移植与新鲜胚胎移植的围产期状况。方法回顾性分析2005年5月至2007年11月经我院生殖中心实施玻璃化冷冻囊胚复苏移植术后妊娠分娩132例（A组）的围产结局,以同期IVF-ET新鲜卵裂球期胚胎移植250例（B组）的围产期状况作为对照。比较两组的早产率、双胎出生率、剖宫产率、新生儿男女性别比;另外对两组单、双胎妊娠的新生儿胎龄、出生体重、身长、新生儿窒息、新生儿出生缺陷及新生儿死亡的发生率等进行比较。结果A组132例共分娩163个新生儿,男女性别比为1．26：1;B组250例分娩332个新生儿,男女性别比为0．91：1;两组比较无统计学差异（P〉O．05）。单胎新生儿分析：A组单胎新生儿共有101个,平均胎龄为（277．4±15．1）d,平均体重和身长分别为（3,377．1±580．0）g和（49．9±2．6）cm;B组单胎新生儿共有165个。平均胎龄为（273．4±17．7）d,平均体重和身长分别为（3,257．9±542．6）g和（49．3±2．8）cm;两组比较无统计学差异（P〉0．05）。巨大儿出生率A组（15．8%）显著高于B组（7.3％）（P〈0．05）;两组低体重出生率、极低体重出生率、新生儿窒息率、新生儿出生缺陷和新生儿死亡率比较无统计学差异（P〉O．05）。双胎新生儿分析：A组和B组中双胎分别有62个和168个新生儿,两组的新生儿平均胎龄、平均体重和身长,分别为（266．7±15．1）d和（258．9±17．8）d;（2.643．6±642．6）g和（2.468．6±501．7）g;（47．7±2．7）cm和（46．8±3．1）cm;低体重出生率分别为21％和37．1％,两组比较均有统计学差异（P〈0．05）。两组双胎新生儿的极低体重、巨大儿、新生儿窒息、新生儿出生缺陷及死亡率之间无统计学差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻囊胚复苏移植后妊娠分     

人类低质量卵裂期胚胎体外发育至囊胚能力的研究

目的探讨体外受精（IVF）治疗中D3低质量胚胎培养至囊胚的发育潜能,为囊胚的培养和冷冻提供依据。方法2010年6～12月进行IVF治疗的患者398例,D3移植后剩余的总胚胎数2,180枚。其中形态学较低质量胚胎1,546枚,采用序贯法微滴培养,D3～D6连续观察囊胚形成情况,比较不同细胞数、碎片含量不同的胚胎囊胚形成的比例。结果1,546枚低质量胚胎,于D5～D6形成426枚囊胚,囊胚形成率为27．56％。其中6Ⅲ、Ⅳ级为40．9％（318／778）;5Ⅰ、Ⅱ级为28．8％（30／104）;4Ⅰ、Ⅱ级为8．9％（16／180）,4Ⅲ、Ⅳ级为19．7％（56／284）;2～3I、Ⅱ级为3．0％（6／200）。经统计学分析,碎片较多的胚胎中,卵裂球数目较多的胚胎,囊胚形成率较高。结论D3形态学较低质量胚胎仍有部分具有发育至囊胚的潜能,因此在D3时对这些胚胎继续进行培养至D6,可能减少胚胎的浪费并得到更好临床结局。     

应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠囊胚的效果观察

目的比较冷冻环玻璃化冷冻小鼠各阶段囊胚的存活率及继续发育能力。方法应用冷冻环以15%二甲基亚砜(DMSO)+15%乙二醇(EG)为主要组成的玻璃化冷冻液,冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个,以同期未冷冻囊胚(100个)作对照;并于冷冻前人工皱缩小鼠囊胚30个,以同期未皱缩的囊胚(50个)为对照。比较冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果小鼠早期囊胚、囊胚、扩张囊胚各组的存活率分别为88.4%、69.2%和55.2%,囊胚孵出率分别为82.8%、65.1%和60.3%。早期囊胚组复苏后的存活率和囊胚孵出率均显著高于囊胚组和扩张囊胚组(P<0.05)。冷冻前人工皱缩扩张期囊胚,冷冻复苏后存活率达93.8%,孵出率78.1%,与未皱缩组比较差异有显著性(P<0.05)。结论玻璃化冷冻囊胚的效果与囊胚的发育阶段有关;冷冻前人工皱缩囊腔体积能明显提高扩张囊胚玻璃化冷冻的效率。     

二次玻璃化冻融囊胚对临床结局和新生儿结局的影响

目的 研究胚胎经历二次玻璃化冻融后的临床结局及新生儿结局.方法 回顾性分析2017年1月至2020年4月在本院生殖医学中心接受二次冻融复苏单囊胚移植的患者资料(双冻组,n=49),使用1:3倾向性评分匹配选取同期进行常规单次冻融复苏单囊胚移植的患者作为对照组(单冻组,n=147).比较两组患者的一般情况、着床率、临床妊...     

3种囊腔人工皱缩技术在小鼠扩张期囊胚玻璃化冷冻中的比较研究

目的:比较3种囊腔人工皱缩技术在小鼠扩张期囊胚玻璃化冷冻中的应用,以其建立一种有效的扩张期囊胚玻璃化冷冻预处理方法。方法:扩张期囊胚玻璃化冷冻前分别采用注射针抽吸、拉细管吹打、激光打孔方法预先人工皱缩囊腔,分别与未处理囊腔组比较复苏后囊胚的存活率和孵出率。结果:应用注射针抽吸、拉细管吹打、激光打孔预先处理囊腔,囊胚复苏后的存活率分别72.9%、72.0%、94.0%,显著高于未处理组(40.0%,P<0.05)。囊胚复苏后的囊胚孵出率分别64.6%、32.0%、62.0%,显著高于未处理组(16.0%,P<0.0.5)。结论:预先人工皱缩囊腔,对小鼠扩张期囊胚玻璃化冷冻是一种行之有效的预处理技术,尤以注射针抽吸和激光打孔法为佳。     

人类胚胎冷冻:真的到了由慢速向玻璃化方法过渡的时代?

自第一例冻融人类胚胎获得妊娠以来,胚胎冷冻已经成为辅助生殖技术中的一项常规操作.近年来,玻璃化冷冻技术成功用于冻存人类卵母细胞及胚胎.那么,玻璃化冷冻方法已经安全到可以广泛应用,甚至可以取代慢速冷冻方法了吗？实际上仍有许多问题有待解决,包括冷冻保护剂毒性、开放式载体的交叉污染、复苏胚胎发育潜能及损伤鉴定等.     

囊胚期胚胎玻璃化冷冻技术的临床应用研究(附一例成功分娩报道)

总结本中心囊胚期胚胎玻璃化冷冻方法在临床应用结果,探讨该冷冻方法临床应用的意义。一、资料与方法1.对象:对本中心2003年10月3日至11月28日17周期进行53个囊胚期行玻璃化冷冻,其中6周期16个囊胚解冻,目前还有37个囊胚继续冻存中。2.囊胚期胚胎的培养和玻璃化冷冻保存:在行体     

冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏效果的比较

目的比较冷冻环玻璃化法与程序冷冻法对人囊胚冷冻复苏的效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者的剩余胚胎进行培养,所获得的囊胚分别进行程序冷冻法或冷冻环玻璃化法冷冻,比较囊胚复苏后的复苏率、妊娠率等指标。结果玻璃化冷冻复苏39个周期,115个囊胚、存活104个(90.4%),移植38个周期、74个囊胚,临床妊娠28个周期(73.7%),其中2例流产,2例足月分娩2个正常新生儿,24例继续妊娠。程序冷冻21个复苏周期,87个囊胚、存活37个(42.5%),移植15个周期、28个囊胚,临床妊娠6例(40%),其中流产1例,2例足月分娩3个新生儿,3例继续妊娠。玻璃化冷冻后的囊胚复苏率显著高于程序冷冻,复苏周期移植取消率显著低于程序冷冻,而临床妊娠率则明显高于程序冷冻,均有统计学差异(P<0.05)。但两种方法的流产率没有显著差异。结论使用冷冻环玻璃化法适于人类囊胚的冷冻保存,其复苏率和妊娠率均显著高于传统的程序冷冻法,复苏周期移植取消率低于程序冷冻法。     

The outcomes of human blastocyst cryopreservation:vitrification using cryoloop versus slow-freezing method

<正> Objective:To compare the outcomes of vitrification using cryoloop with slow-freezing meth-od for human blastocyst cryopreservation.Methods:In IVF-ET cycles,supernumerary embryos were cultured to Day 5 or Day 6,blas-tocysts were cryopreserved by vitrification using cryoloops or slow-freezing method,then blasto-cyst survival rate and pregnant rate were compared.Results:115 vitrified blastocysts from 39 cycles were warmed,104(90.4%)blastocysts sur-vived.After the transfer of 74 blastocysts in 38 cycles,28(73.7%)women got clinically preg-nant,2(7.1%)of them suffered from miscarriage,2 healthy babies were born in 2 deliveries,and the other 24 pregnancies are ongoing.As to slow-freezing method,87 blastocysts from 21 cy-cles were thawed,37(42.5%)of them survived,28 blastoeysts were transferred in 15 cycles,6(40%)women got clinically pregnant,1 of them miscarried,3 healthy babies were born in 2 de-liveries,and the other 3 pregnancies are ongoing.Conclusion:The survival rate and pregnant rate of vitrification using cryoloop are superior totraditional slow-freezing method,and the transfer cancel rate is lower than that of slow-freezingmethod.The miscarriage rate is similar in two methods.     

The application of vitrification in human blastocyst cryopreservation: Analysis of clinical outcome of 117 cycles

Objective: To summarize the clinical outcomes of 117 human vitrified blastocyst transfer cycles and to determine the impact factors.Methods: In IVF-ET cycles, supernumerary embryos were cultured to 5-Day(D5) or 6-Day(D6), blastocysts of various stages were cryopreserved by vitrification using cryoloops. Survival rate and clinical pregnancy rate were observed.Results: A total of 312 blastocysts were thawed in 117 frozen embryo transfer cycles, the survival rate was 90.7% (283/312) after thawing. After the transfer of 230 blastocysts in 115 cycles, 69.6% (80/115) of the women got clinically pregnant, and 17.5% (14/80) of them suffered from miscarriage, 39 healthy babies were born in 28 deliveries, and the other 38 pregnancies are ongoing. The implantation rate was 47.4% (109/230). In 107 transfer cycles with 2 hatched blastocysts transferred in each cycle, 72.9% (78/107) got clinically pregnant, while in 8 cycles with 1 or no hatched blastocysts in the two transferred blastocysts, the clinical pregnancy rate is 25%(2/8). The clinical pregnancy rates were not statistically different between natural (77.4%, 24/31) or artificial endometrium preparation (66.7%, 56/84) cycles. Conclusions: These findings suggest that blastocyst vitrification is effective in terms of implantation rate and pregnancy outcome. Transferring of two hatched blastocyst can achieve a higher pregnancy rate.     

不同阶段小鼠囊胚玻璃化冷冻保存效果观察

目的探讨合适玻璃化冷冻保存的小鼠囊胚发育阶段。方法对575枚小鼠初级囊胚和577枚扩张囊胚分别采用六组玻璃化溶液进行玻璃化冷冻,比较不同阶段囊胚的冷冻保存效果。结果各组初级囊胚存活率和孵出率均高于扩张囊胚。除ES35组外,各组初级囊胚存活率均显著高于扩张囊胚（P〈0．05）;EDS35、ESF20和EDSF20组的初级囊胚的孵出率均显著高于扩张囊胚（P〈0．05）。结论初级囊胚较扩张囊胚更适合玻璃化冷冻保存。     

人卵巢组织玻璃化冻存方案优选的实验研究

目的评价4种玻璃化冷冻保存液对人卵巢组织的冻存效果,以筛选出较优的玻璃化冷冻保存液配方。方法收集2018年3月至2019年12月期间在北京大学深圳医院妇科因疾病手术治疗的4例患者的卵巢组织,将人卵巢分割为(5~10)mm×10 mm×1 mm大小的组织块进行玻璃化冷冻保存,根据玻璃化冷冻保存液组成成分不同将组织块随机分为4组[A组为20%乙二醇(EG)+20%二甲基亚砜(DMSO)+0.5 mol/L蔗糖+20%人工合成血清替代品(SSS)+M199培养基;B组为38%EG+0.5 mol/L海藻糖+6%SSS+M199培养基;C组为15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20%SSS+M199培养基;D组为商品化Cryotissue Kit VT301/VT302成品]以及对照组(未经冻融处理的新鲜卵巢组织)。采用液氮液滴法在显微镜下观察4种保存液在快速降温和复融时的玻璃化状态;HE染色比较冻存后各组卵巢组织形态学改变;采用免疫组化法检测各组中凋亡标志物细胞色素C(Cytochome C)与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况。结果液滴法检测发现,在液氮中快速降温时A、B和D组冻存液均能保持完全玻璃化状态,C组冻存液呈部分结晶;在复融过程中,A、B和C组冻存液均出现结晶,D组冻存液则绝大部分保持透明的玻璃化状态。HE染色结果发现,A、B、C和D组人卵巢组织中的正常卵泡率与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);免疫组化结果显示,D组和对照组卵泡中Cytochome C显著低于C组(P<0.05),C组卵泡Caspase-3阳性率显著高于其他组(P<0.05)。结论通过液氮液滴法观察冻存液在快速降温和复融时的玻璃化状态方便直观,可用于对人卵巢组织玻璃化冷冻液的初步筛选;商品化Cryotissue Kit VT301/VT302冻存液冻融后人卵巢组织细胞凋亡较少,为较优的冻存液配方。     

Intramatrix events during cryopreservation of porcine articular cartilage using rapid cooling.

Cryopreservation of articular cartilage may improve long-term transplantation results if cell and matrix integrity can be maintained. This study examined intramatrix events in intact porcine articular cartilage that occurred during a rapid-cooling technique with various concentrations of dimethyl sulfoxide (DMSO) (1, 3, 5, 6 and 7 M). Thermocouples were inserted into the solution and in the cartilage matrix to record the temperature during rapid cooling. In addition, scanning electron microscopy of freeze-substituted samples was performed and quantitatively evaluated for the areas representing ice in the matrix. The results of this study showed that low concentrations of DMSO resulted in the largest temperature gradient between the matrix and the surrounding solution, which occurred near the freezing point of the cryoprotectant solution. At higher concentrations of DMSO, the peak temperature gradient occurred near the glass transition temperature. The temperature measurements suggested that a significant amount of ice formed within the matrix at lower DMSO concentrations. At higher DMSO concentrations that resulted in vitrification of the external solution, there was evidence of some ice in the matrix. The scanning electron micrographs demonstrated significantly more matrix disruption (likely due to ice formation) (P<0.02) in the lower DMSO concentrations (1 and 5 M) while the 6 M DMSO concentration demonstrated minimal matrix disruption. Cryopreservation of articular cartilage with a rapid-cooling technique and high concentrations of DMSO resulted in partial vitrification of the matrix and significantly less matrix disruption. It appears that successful cryopreservation of viability and function in articular cartilage will require high concentrations of cryoprotectants and rapid cooling.     

卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局的影响

目的探讨玻璃化冷冻对卵母细胞体外受精、胚胎发育以及妊娠结局的影响。方法将193枚玻璃化冷冻卵母细胞解冻复苏,采用卵胞浆内单精子注射法受精,观察胚胎发育形态,经72h体外培养后移植。结果成熟卵母细胞解冻复苏率为75．6％,正常受精率为72．6％,卵裂率为88．7％,优质胚胎率为48．9％。共移植19例,9例妊娠,已分娩2例,临床妊娠率为47．3％。新鲜周期与冻卵解冻周期相比,卵裂率、可移植胚胎率和优质胚胎率均无显著性差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻方法对成熟卵母细胞的胚胎发育及妊娠结局无显著影响。