缺失激素结合区的人糖皮质激素受体突变体的研究

目的：构建缺失激素结合区（LBD）的人糖皮质激素受体突变体表达载体，并研究其表达和功能。方法：运用RT-nested PCR扩增人糖皮质激素受体（CR）基因不含编码LBD的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体，测序筛选编码正确的重组质粒；荧光显微镜观察GR突变体重组质粒转染人巨噬细胞株U937后的表达情况；相对荧光素酶法检测转染后细胞GR转录激活活性。结果：扩增出长1601bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞GR转录激活活性增强。结论：成功构建缺失LBD的GR突变体表达载体，该突变体具有不依赖激素的GR转录激活活性。     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的 构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体.方法 以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞.结果 PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT.质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体.     

MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性

目的 探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其转录激活活性的相关性.方法 PCR法扩增富含组氨酸钙结合蛋白(histidine-rich calcium-binding protein,HRC)基因启动子/增强子序列,插入报告载体pGL3-Basic中,生成pGL3-HRC enhancer质粒,该质粒与全长野生型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA,或含4～15个CAG的变异型MEF2A cDNA表达质粒pCDNA-MEFcDNA-CAGr,以及内参质粒pRL-TK,用脂质体转染法共转染于293T细胞,Westernblot检测MEF2A蛋白的表达,双荧光素酶检测系统测定报告分子的表达.结果 成功构建了MEF2A蛋白体外转录激活活性检测系统;所构建的含4～15个CAG序列的MEF2A变异蛋白,与含11个CAG序列的野生型MEF2A蛋白之间其转录激活活性没有显著性差异.结论 目前已发现的MEF2A第11号外显子CAG重复数目的 改变不会影响MEF2A蛋白的转录激活活性.     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体。方法以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT。质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体。     

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。方法 采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。结果 菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高（P<0.05）。结论 成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升...     

RNA干扰技术对人U937巨噬细胞株糖皮质激素受体表达及功能的抑制效应

目的利用载体介导的RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体(GR)基因阻断的人U937巨噬细胞株模型.方法构建两个针对GR的RNAi重组表达载体,分别命名为pSilencer 3.1-GR1和pSilencer 3.1-GR2,经测序确认后,转染人U937巨噬细胞株.RT-PCR、Western blot分别检测糖皮质激素受体mRNA水平和蛋白水平表达变化;相对荧光素酶活性法检测地塞米松作用后GR转录激活功能的变化.结果经测序证实:成功构建两个针对GR的RNAi表达载体(pSilencer 3.1-GR1和pSilencer 3.1-GR2);转染pSilencer 3.1-GR2可明显降低细胞内GR mRNA的丰度及GR蛋白表达,细胞内GR转录激活功能明显降低;转染pSilencer 3.1-GR1与对照组相比无显著变化.结论成功地构建并筛选出一个高效且特异阻断GR表达及功能的RNAi质粒表达载体,为进一步研究糖皮质激素受体的功能提供新方法.     

STAT6报告基因的构建与在成纤维细胞中表达

目的构建携带信号转导子与转录活化子6(STAT6)基因的真核表达载体,为进一步研究STAT6转录因子在肺纤维化中的作用与作用机制提供基础.方法:以含有STAT6的基因文库为模板通过PCR反应扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光报告基因的真核表达质粒中,经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-STAT6作进一步鉴定.将重组质粒pEGFP-STAT6转染到成纤维细胞中.结果:STAT6基因能正确克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建成重组质粒pEGFP-STAT6.STAT6基因在成纤维细胞中表达.结论:成功构建pEGFP-Stat6重组质粒,并在成纤维细胞中表达.     

hTERT基因片段真核表达质粒载体的构建

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的基因表达载体,为人们建立永生化的细胞系提供材料,为临床细胞移植的实验研究和疾病治疗奠定实验基础.方法 根据hTERT全长cDNA序列设计引物进行PCR扩增,扩增用的模板是人胎脑cDNA文库,PCR扩增产物与pGEM-T载体连接后进行测序鉴定.结果 PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功.产物测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.87%,氨基酸序列的同源性为99.67%.结论 成功构建了hTERT真核表达质粒.     

人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达

目的 构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法 设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

Cloning and identification of a novel variant of human vascular endothelial growth factor

Vascular endothelialgrowth factor ( VEGF) is amultifunctional cytokine thatexerts in vivo a key rolein physiologicalneoangiogenesisduring embryonicde-velopmentor the female cycle and pathologicalneoan-giogenesis of many diseases including hypervascular-ized tumors,rheumatoid arthritis,and retinopathiesdiseases[1— 3] by stimulating endothelial cell prolifera-tion and vessel hyperpermeability.VEGF exists asone of five different isoforms,VEGF1 2 1 ,VEGF1 65 ,VEGF1 83,VEGF1 89and VEGF2 …     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。