实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqm an探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×102~5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035~0.39,CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%。结论:本研究建立Taqm an实时荧光定量PCR用于对虾IH-HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

TaqMan探针检测转基因大豆含量方法的建立及应用

目的建立TaqMan探针法检测转基因大豆含量的实时定量PCR方法并应用于市售转基因食品含量的检测。方法以0、0．1％、0．5％、2．0％、5．0％的转基因大豆RoundUp Ready^TM为标准品（Fluka公司），以特异TaqMan探针序列：5’（FAM）-cccactatcettcgcaagaccct-3’（TAMRA），引物序列F：5’-tgatgtgatatctccactgacg-3’，R：5’-tgtatcccttgagceatgttgt-3’，用实时荧光定量PCR方法扩增转基因大豆外源基因CP4EPSPS基因，在实验室建立定量转基因大豆检测的标准曲线，并对市场抽检的豆奶粉、素鸡、热狗肠、黄豆等12种豆类食品及制品进行含量分析。结果在实验室建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测转基因大豆含量的方法，得到0值对转基因食品百分含量对数值的标准曲线方程式为Y=-2．8194X＋27．1855，相关系数值R^2为0．9994。12种市售大豆及制品中五香茶干、豆奶粉、素鸡、热狗肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2．46％、6．26％、13．95％、0．48％、0．66％，其余7份样品为阴性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR法能够快速地进行转基因大豆含量的检测，并可应用于市售转基因食品的检测。     

裂谷热病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于裂谷热病毒的检测。方法通过序列对比在裂谷热病毒L基因保守区设计引物及Taqman探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达37拷贝/μl,通过检测同为蚊媒传播的日本脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒无交叉反应。结论本方法的建立在国境口岸传染病的防控方面有较好的应用前景。     

基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒。方法通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应。结论该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景。     

登革1型病毒荧光定量PCR快速检测

目的建立登革1型病毒的快速特异的荧光定量PCR检测方法。方法设计登革1型病毒特异的引物和TaqMan探针,制作标准曲线,并检测其特异性、重复性、再现性和敏感性,采用荧光定量PCR和常规PCR对临床标本进行检测比较。结果成功构建了标准曲线,回归方程为Y=-3.410logX+45.10,相关系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,灵敏度可达103 copies/mL,此荧光定量PCR方法对登革1型病毒检测高度特异,与其他3型登革病毒和乙型脑炎病毒之间并无交叉反应;采用登革病毒种特异引物探针和本研究建立的登革1型病毒型特异引物探针对166份cDNA样本进行荧光定量PCR检测,均发现126份为阳性,阳性率均为75.9%,Ct值为20.84～36.36,浓度范围为1～1.3×104copy/μL;常规PCR方法检测到其中36份为阳性,阳性率为21.7%。结论荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测登革1型病毒,并能实现对病毒滴度的绝对定量。     

泰泽氏菌TaqManMGB探针荧光定量PCR方法的—立及应用

目的 建立泰泽氏菌的TaqMan小沟结合物(MGB)探针荧光定量PCR检测方法.方法 针对泰泽氏菌16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年采集的1156份临床样本进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 泰泽氏菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肝螺杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌之间无交叉反应,检测灵敏度达2.2 copy/μl.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.204,PCR效率为100％.对1156份临床样本进行检测,荧光定量PCR检出101份泰泽氏菌阳性样本,而普通PCR则仅检出44份.荧光定量PCR方法从临床样本中检出泰泽氏菌DNA仅需2h.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有特异、灵敏和稳定性,适于泰泽氏菌的快速检测.     

荧光定量PCR监测单核细胞增多性李斯特菌研究

目的 探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法 以单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因作为靶序列设计一对引物，并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板，用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果 含有一段特征基因的600bp片段，具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论 荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。     

饮用水大肠菌群Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法研究

[目的]建立快速、灵敏、特异的饮用水大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法.[方法]以大肠菌群的lacZ基因为检测靶基因,设计荧光定量PER引物和Taqman-MGB探针,建立荧光定量PER定量反应体系,并评价荧光定量PER方法的灵敏度、特异性、重复性.[结果]建立大肠菌群的荧光定量PER检测方法.25μl荧光定量PER反应体系主要成分浓度分别为Mg2+5.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L,探针0.5μmol/L,4xROX参比荧光染料0.5μl,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板5μl.方法可检出每微升单个拷贝大肠菌群模板,方法的特异性、重复性良好.[结论]荧光定量PER方法可快速、灵敏、特异地检出水质中大肠菌群,可为饮用水大肠菌群快速检测标准方法的建立提供参考.     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

肠出血性大肠埃希菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异、有效的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重实时荧光PCR检测方法。方法根据GenBank公布的EHEC的stx1和stx2基因序列设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针分别用FAM-BHQ1和HEX-BHQ1标记stx1及stx2,建立双重实时荧光PCR反应体系,并对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。结果显示该方法特异性、重复性好、灵敏度高,最低检出限可达102cfu/ml,117.5fg/μl。结论建立的双重实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR快速检测技术。方法 人工合成扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白GP基因上1 969～2 113 bp的保守特异片段,克隆到pUC57重组质粒中,构建阳性模板;以103～109拷贝数的重组质粒样品共7组作为标准品,制作标准曲线;设计上游引物5' - GAACCACATGATTGGACCAAGA - 3'、下游引物5' - TAACTCCAATACCTGCCGGTATC - 3'及TaqMan探针FAM 5' - TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG - 3' BHQ1,采用普通PCR和实时荧光定量PCR,检测其特异性和灵敏度。结果 克隆出含GP 1 969～2 113 bp片段的阳性重组质粒pUC57 - GP,其浓度为97.75 ng/μl;以pUC57 - GP为标准品,制备标准曲线,拷贝数为103～109 copies/μL有较好线性关系,相关系数R2 = 0.999;能特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒,而与I型登革病毒、寨卡病毒无交叉反应,其检测最低拷贝数达3.10×101copies/μl。 结论 建立了扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR快速检测技术,具有快速、灵敏、特异、定量检测等特点,可为埃博拉疫情的综合防控提供技术支撑。     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

荧光定量PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O104

目的建立针对肠出血性大肠杆菌O104的荧光定量PCR快速检测方法。方法针对O104的wzx保守基因,设计特异性引物和探针,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外34株肠道致病菌评价检测方法的特异性;建立了肠出血性大肠杆菌O104感染食品的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了荧光定量PCR快速检测肠出血性大肠杆菌O104的方法。每次检测最低限为12.0copies,特异性为100%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中具有应用前景。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

Real-time PCR assay for the detection and quantification of Legionella pneumophila in environmental water samples: utility for daily practice

We developed a quantitative real-time PCR assay targeting the mip gene of Legionella pneumophila for a prospective study from September 2004 to April 2005. It was compared with a standard culture method (French guideline AFNOR T90-431), analysing 120 water samples collected to monitor the risk related to Legionellae at Nantes hospital and to investigate a case of legionellosis acquired from hospital environment. Samples from six distinct water distribution systems were analysed by DNA extraction, amplification and detection with specific primers and FRET probes. The detection limit was 100 genomic units of L. pneumophila per liter (GU/l), the positivity threshold about 600 GU/l and the quantification limit 800 GU/l. PCR results were divided into three groups: negative (n=63), positive but non-quantifiable (n=22) or positive (n=35). PCR showed higher sensitivity than culture, whereas four culture-positive samples appeared negative by PCR (PCR inhibitor detected for two of them). Although no correlation was observed between both methods and real-time PCR cannot substitute for the reference method, it represents an interesting complement. Its sensitivity, reproducibility and rapidity appear particularly interesting in epidemic contexts in order to identify the source of contamination or to evaluate critical points of contamination in water distribution systems.     

流行性腮腺炎病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)核酸。方法针对MuV血凝素(H)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、灵敏度与准确性;并通过体外克隆技术建立MuV基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针的优化浓度分别为880mmol/L和280mmol/L,具有良好的保守性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;方法检测灵敏度为10拷贝/反应,相当于0.01TCID50,标准曲线线性范围为107~10拷贝/反应;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。结论TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,为MuV的早期快速检测提供了一种新的检测技术。     

用TaqMan探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针，进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析，优化反应体系，检测其灵敏度、特异性和重复性。结果以EV76灭活培养物为对象，检测灵敏度可达每反应体系0．08CfU；30株非鼠疫菌株的检测结果表明，对照菌株均为阴性，检测特异性良好；对同一样品进行17次重复检测，其循环阈值的标准偏差为0．35。结论TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测，为鼠疫监控、诊断提供有力手段。     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。