氢醌对L-02肝细胞损伤的研究

[目的]探讨氢醌(HQ)对L-02肝细胞损伤及其可能的作用机制。[方法]应用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度分别为0、5、10、20、40、80、160和320gmol/L的HQ作用24h后对L-02肝细胞存活率的影响;利用万能倒置显微镜观察不同浓度HQ染毒之后L-02肝细胞的形态学改变并摄影成像;利用全自动生化分析仪检测不同浓度HQ染毒24h后L-02肝细胞的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,以观察HQ对L-02肝细胞膜完整性的影响。[结果]在0～80μmol/L浓度的范围内染毒24h后,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05);浓度≥160μmol/L时,染毒24h后,存活率则明显下降(P<0.01),LDH漏出率、ALT和AST活性均有随着HQ浓度的增加而升高的趋势;160和320μmol/L组LDH漏出率与对照组比较有明显升高(P<0.01)。但ALT和AST活性只在320μmol/L组与对照组比较才有明显增加(P<0.01)。此外,160和320μmol/L组L-02肝细胞的形态与对照组相比发生了明显的改变。[结论]HQ可能是通过损伤细胞膜而对L-02肝细胞产生毒性影响。     

亚砷酸钠对L-02肝细胞的氧化损伤作用

[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人肝细胞株(L-02)的氧化损伤作用. [方法]用不同浓度NaAsO2(50,100,150 μmol/L)染毒L-02肝细胞24 h,MTT法检测NaAsO2对L-02肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测L-02肝细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;钼酸铵法测定过氧化氢酶(catalase,CAT)活性;单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)法检测DNA损伤. [结果]NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,50、100、150 μmol/L浓度NaAsO2组的L-02肝细胞存活率和CAT活性与对照组相比显著降低(P<0.01).且呈剂量-反应关系;100、150μmol/L浓度NaAsO2组ROS生成量显著增多(P<0.01);50 μmol/L的NaAsO2即可引起出现彗星现象的细胞数明显高于对照组,拖尾细胞阳性率明显升高(P<0.01),且呈剂量-反应关系. [结论]NaAsO2对L-02肝细胞的生长具有明显的抑制作用,可引起L-02肝细胞内ROS增多和CAT活性降低,引起细胞DNA损伤.     

亚硝酸钠对人肝细胞L-02作用机制的研究

目的:探讨食品添加剂亚硝酸钠对人肝细胞L-02的作用机制。方法:将L-02肝细胞分别暴露于含0、0.625、2.5、10 mmol/L的亚硝酸钠培养液中24 h,MTT法检测细胞活力,酶联免疫吸附法测定培养液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdelyde,MDA)含量。结果:与对照组相比,低、中剂量组L-02的OD值、存活率、SOD、GSH-Px略微升高,LDH、ALT、AST、MDA略微降低,但差异无统计学意义(P0.05);与对照组相比,高剂量组OD值、存活率、SOD、GSH-Px明显降低,LDH、ALT、AST、MDA明显升高,且与低、中剂量组比较差异均有统计学意义(P0.01)。结论:亚硝酸钠对L-02细胞具有毒物兴奋效应,其剂量—反应关系为反U型,在低剂量条件下表现为适当的刺激(兴奋)作用,其机制可能与一氧化氮的产生与作用有关;而在高剂量条件下表现为抑制作用,其机制与氧化损伤有关。     

双酚A对人胚肝细胞L-02的毒性作用研究

[目的]探讨双酚A对肝细胞L- 0 2的毒性作用及可能损伤机制。[方法] 1、10、5 0、10 0 μmol/L浓度的双酚A作用肝细胞L 0 2后,检测双酚A对肝细胞L-0 2的存活率、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量变化、细胞凋亡及凋亡相关基因P5 3、caspase3mRNA表达的影响。[结果]双酚A处理后,肝细胞L 0 2的存活率随着双酚A浓度的增加而下降,在≥5 0 μmol/L浓度,细胞的存活率显著降低(P <0 .0 1)。双酚A诱导肝细胞L -0 2中的SOD含量降低(P <0 .0 1) ,GSH和MDA含量在1μmol/L明显降低(P <0 .0 5 ) ,而后随着剂量的增加升高明显(P <0 0 1)。CAT水平先随着剂量的增加而升高到10 μmol/L的(10 5 .68±9.63 )U/g蛋白,而后随着剂量的增加而显著降低(P<0 .0 1)。≥5 0 μmol/L浓度的双酚A能明显诱导肝细胞L 0 2凋亡和P5 3、caspase3mRNA的表达升高(P <0 .0 1)。凋亡率从对照组的(8.16±0 .0 7) %上升到10 0 μmol/L的(17.2 0±1.2 5 ) % ,5 0、10 0 μmol/L浓度P5 3和caspase3mRNA表达分别是对照组的(1.42±0 .2 5 )、(1.65±0 .13 )、(1.41±0 .12 )和(1.77±0 .0 6)倍。[结论]双酚A对肝细胞L 0 2具有细胞毒性和氧化损伤作用,并能诱导肝细胞L 0 2发生凋亡和P5 3、caspase3mRNA的表达升     

双酚A对人胚肝细胞DNA损伤和修复功能的影响

[目的]研究双酚A(BisphenolA,BPA)对人肝L-02细胞DNA损伤修复功能的影响。[方法]分别以1、10、50、100μmol/LBPA和100μmol/LBPA+30μg/LVitC处理L-02细胞,比较处理和未处理的人胚肝L-02细胞在DNA损伤程度、切除修复鼠缺陷交叉互补蛋白1(ERCC1)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、错配修复hMSH2基因(hMSH2)、DNA依赖蛋白激酶复合物(DNA-PKcs)及O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)表达水平的差异。每组细胞数均为1×106个/ml。[结果]BPA处理后,彗星试验显示BPA在低剂量(10μmol/L)时即具有DNA损伤作用(P<0.05),随着剂量增大,DNA损伤效应增加。100μmol/LBPA+30μg/LVitC组DNA损伤效应降低,显示抗氧化剂VitC可减缓BPA所致的DNA损伤效应,氧化损伤是BPA所致DNA损伤的方式之一。5种DNA损伤修复酶表达水平在1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L剂量组依次降低,在100μmol/L、100μmol/L+VitC组依次增加,50μmol/L组各种DNA损伤修复酶表达水平最低。BPA50μmol/L组与溶剂对照比较,5种DNA损伤修复酶均有明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。100μmol/L组的表达水平均高于50μmol/L组,100μmol/L+VitC组均高于100μmol/L组。除DNA-PKcs与hMSH2外,其他DNA损伤修复酶在100μmol/L+VitC组与溶剂对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。[结论]BPA对L-02细胞具有氧化损伤作用,并可导致DNA损伤,多种DNA损伤修复酶参与修复双酚A所导致的DNA损伤。VitC可减缓双酚A的DNA损伤作用。     

亚硫酸钠对人肝细胞L-02损伤机制的研究

目的:探讨食品添加剂亚硫酸钠对人肝细胞L-02的损伤机制。方法:将L-02肝细胞分别暴露于含0、2.5、5、10 mmol/L的亚硫酸钠培养液中24 h,MTT法检测细胞活力,酶联免疫吸附法测定培养液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdelyde,MDA)含量。结果:与对照组相比,各剂量组L-02的存活率、SOD、GSH-Px均降低,且随着Na2SO3染毒剂量的增加而逐渐降低,Slow、Smidlle、Shigh组间比较差异均有统计学意义(P0.01);LDH、ALT、AST均升高,且随着Na2SO3染毒剂量的增加而逐渐升高,Slow、Smidlle、Shigh组间比较差异均有统计学意义(P0.01);Na2SO3与存活率、SOD、GSH-Px间均为负相关关系(P0.01),与LDH、ALT、AST、MDA间为正相关关系(P0.01)。结论:亚硫酸钠对肝细胞有毒性作用,其机制与肝细胞细胞膜损伤和氧化应激有关,ALT可作为亚硫酸钠对肝细胞损伤的早期敏感生物学标志物。     

富勒烯对人胚肝细胞内过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶mRNA的表达的影响

目的探讨富勒烯(C60)对人胚肝细胞(L-02)内过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)mRNA表达的影响。方法将对数生长期的人胚肝细胞接种于96孔培养板(细胞密度为104个/孔),随机分为对照组(生理盐水)和1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00μg/ml富勒烯染毒组,培养24h后,采用MTT试验检测富勒烯对细胞存活率的影响。将人胚肝细胞分别暴露于0、1.00和20.00μg/ml富勒烯24h,采用实时定量PCR法检测细胞内CAT、GSH-Px和SODmRNA的相对表达量。结果与对照组比较,1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00μg/ml富勒烯染毒组的细胞存活率均降低,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);且细胞存活率随富勒烯染毒剂量的增加而降低。与对照组比较,1.00μg/ml富勒烯染毒组GSH-Px和SOD以及20.00μg/ml富勒烯染毒组CAT、GSH-Px和SODmRNA相对表达水平较低,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);且人胚肝细胞中CAT、GSH-Px、SODmRNA的相对表达水平随着富勒烯染毒剂量的增加而降低。结论富勒烯可通过降低人胚胎肝细胞内CAT、GSH-Px和SODmRNA的表达水平,引起肝细胞发生过氧化损伤。     

三价铬与六价铬化合物对L-02肝细胞毒性的比较

目的　评价三价铬 (Cr(III) )和六价铬 (Cr(VI) )对L -0 2肝细胞的细胞毒效应差异。　方法　以L -0 2肝细胞为研究对象 ,用MTT法检测L -0 2肝细胞死亡指数 ,比色法检测细胞内乳酸脱氢酶 (LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶 (AST)的渗出程度。　结果　细胞处理 12h ,Cr(VI)处理组的细胞死亡指数明显高于Cr(III)细胞处理组 ,在 4～ 2 5 6μmol/L浓度范围具有明显的浓度 -效应关系 (相关系数r =0 .945 ,P <0 .0 5 )。细胞处理 5h后 ,Cr(VI)低剂量和高剂量组 (16μmol/L和 12 8μmol/L)LDH的漏出比均明显高于相应剂量的Cr(III) (P <0 .0 5 ) ;在Cr(VI)高剂量组 (12 8μmol/L)ALT与AST的漏出比显著高于相同剂量的Cr(III) (P <0 .0 5 )。　 结论　Cr(VI)对L -0 2肝细胞的细胞毒效应明显大于Cr(III)。     

铜对L-02细胞线粒体的损伤作用

[目的]观察铜对人肝细胞L-02线粒体的损伤作用。[方法]将硫酸铜用D-Hank’s液和培养液稀释成终浓度分别为50、100、150、200μmol/L的硫酸铜与L-02细胞共培养18h,进行量效关系研究;以150μmol/L浓度与L-02细胞共培养0、6、12、18、24h进行时效关系研究。正常对照组：加入与处理组等体积的D-Hank’s液。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测线粒体酶抑制率和整体功能的变化;透射电镜观察线粒体超微结构的变化;罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）结合流式细胞仪（FCM）检测线粒体膜电位（MMP）的变化和细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测细胞色素C的释放。[结果]铜可引起线粒体酶抑制率和线粒体功能的变化;透射电镜下观察到线粒体结构受到不同程度的损伤,并随剂量增大和时间延长损伤加重;FCM结果表明随着铜剂量增大,实验组Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12下降至200μmol/L组59.94±13.55,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%增加至200μmol/L组17.07%（P〈0.05,P〈0.01）。随着铜作用时间的延长,Rh123平均荧光强度逐渐降低,由对照组93.60±18.12降低至24h组55.74±15.45,即膜电位呈逐渐降低趋势;而细胞凋亡率逐渐增加,由对照组2.73%降低至24h组20.45%（P〈0.05,P〈0.01）。免疫细胞化学实验显示,细胞色素C从线粒体释放入胞质,释放量呈现一定的剂量依赖性和时间依赖性。[结论]铜可诱导L-02细胞线粒体损伤,引起膜电位降低,细胞色素C释放入胞质,线粒体结构和整体功能遭破坏,导致细胞损伤甚至凋亡。     

纳米二氧化钛对氯化镉所致人胚肝L-02细胞毒性作用的影响

[目的]研究纳米二氧化钛(nano-TiO2)对氯化镉(CdCl2)所致人胚肝细胞毒性作用的影响. [方法]不同浓度的CdCl2(0.001、0.01、0.1 μmol/L)单独或与0.01 mg/L nano-TiO2混合后,分别作用干人胚肝L-02细胞24h,观察各组L-02细胞的DNA损伤水平,以及hMsh2基因(hMsh2)、O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖蛋白激酶复合物催化亚基(DNA-PKcs)的mRNA表达水平. [结果]与相应剂量的CdCl2单独染毒组比较,nano-TiO2与各浓度的CdCl2混合染毒组L-02细胞的DNA损伤加重(P＜0.05),hMsh2表达水平明显上升(P＜0.05),MGMT表达水平无显著性变化,nano-TiO2与0.01、0.μmol/L的CdCl2混合染毒组DNA-PKcs的基因表达水平明显上升(P＜0.05).[结论]0.01mg/L的nano-TiO2可以加重各浓度CdCl2对L-02细胞的DNA单链损伤,从而使CdCl2对L-02细胞毒性作用增强.     

铜致L-02细胞的氧化应激及凋亡的影响

[目的]研究铜致人肝细胞L-02的氧化应激及凋亡的影响。[方法]噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长活性。黄嘌呤氧化酶法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活力。比色法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量。硫代巴比妥酸法（TBA）检测氧化产物丙二醛（MDA）含量。流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。[结果]铜呈剂量依赖性和时间依赖性地抑制细胞生长活性，50、100、150、200μmol／L浓度组细胞生长抑制率分别为6．27％、16．89％、30．64％和39．32％，6、12、18、24h组分别为7．63％、16．83％、33．66％和38．74％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。铜抑制细胞培养上清液中抗氧化酶SOD活性，降低GSH含量，使氧化产物MDA生成增加，各浓度组与与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。FCM结果表明随着铜浓度增大和时间延长，细胞凋亡率逐渐上升。5、100、150、200μmol／L浓度组细胞凋亡率分别为4．06％、8.39％、13．81％和17．07％，6、12、18、24h组分别为5.30％、7．39％、13.81％和20．45％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。[结论]铜可致人肝细胞L-02氧化应激，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡。     

双酚A对人胚肝细胞凋亡的影响

[目的]研究双酚A(BPA)对人胚肝L-02细胞的凋亡的影响。[方法]以MTT来分析不同浓度BPA对人胚肝L-02细胞的细胞存活率的影响;用流式细胞术分析不同浓度BPA对细胞凋亡的影响;通过RT-PCR分析BPA引起的生长抑制、DNA损伤基因GADD45、GADD153、GADD34表达水平的变化。[结果]BPA处理后,L-02细胞的生存率随着BPA浓度的增加而下降,在≥50μmol/L,细胞的存活率显著降低(P<0.01)。随着BPA浓度升高,细胞凋亡率增加,≥50μmol/L可显著升高L-02细胞的凋亡率(P<0.01)。生长抑制DNA损伤基因GADD45、GADD153.GADD34表达水平随着BPA浓度增加表达量也增加,100μmol/LBPA组显著高于正常对照组,但在100μmol/L,BPA+VitC组三种GADD基因表达量均稍降低。[结论]BPA对L-02细胞具有细胞毒性作用,可导致细胞凋亡率升高,与细胞生长调控和DNA损伤相关的GADD45、GADD153、GADD34基因表达升高,VitC可减缓BPA对DNA的损伤作用。     

双酚A及纳米二氧化钛对人胚肝L-02细胞内活性氧含量及DNA损伤的联合作用

[目的]观察双酚A（BPA）、纳米二氧化钛（nano-TiO2）单独及联合作用对人胚肝L-02细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量及DNA损伤的影响。[方法]生长良好的L-02细胞，分别单独加入0．1、1、10μmol／L的BPA，1、5、10mg／L的nano-TiO2，以及上述各浓度的BPA和nano-TiO2混合染毒24h；采用流式细胞仪检测各组L-02细胞内ROS含量，采用彗星试验观察各组DNA断裂损伤程度。[结果]10μmol／L BPA单独染毒组，1mg／L nano-TiO2与1、10μmol／L BPA，以及5、10mg／L的nano-TiO2分别与0．1、1、10μmol／L BPA联合作用于L-02细胞后，均可引起ROS含量升高，DNA断裂损伤加重，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．001）；而nano-TiO2单独染毒组对于L-02细胞ROS的升高、DNA损伤作用与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。析因分析结果显示两种受试物混合染毒存在协同作用。[结论]BPA和nano-TiO2联合作用可增加各自对L-02细胞内ROS水平和DNA损伤断裂水平的影响，对细胞的损伤作用增大。     

氢醌诱导L-02肝细胞凋亡的研究

目的探讨氢醌(HQ)对体外培养L-02肝细胞凋亡(apoptosis)的影响和HQ毒性作用的分子机制。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度HQ(0,5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后L-02肝细胞的相对存活率;采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测HQ染毒后的细胞凋亡状况。结果HQ在0~80μmol/L的染毒剂量范围内,对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响(P>0.05),当HQ染毒剂量超过160μmol/L时,L-02肝细胞的存活率则明显地下降(P<0.01)。10,20,40,80,160和320μmol/L组L-02肝细胞DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯状条带,并且随着HQ染毒剂量增加而渐趋明显。流式细胞术检测显示,HQ各染毒剂量组(5,10,20,40,80,160和320μmol/L)作用24 h后均可引起L-02肝细胞的调亡,并呈现出一定的剂量—反应关系;此外,还可出现明显的亚二倍体峰。结论HQ在体外能够诱导L-02肝细胞发生凋亡。     

滴滴涕与纳米二氧化钛对人胚肝细胞DNA损伤作用的协同效应

[目的]观察滴滴涕（DDT）及纳米二氧化钛（nano-TiO2）单独及联合体外染毒对人胚肝细胞株（L-02）内活性氧（ROS）含量及DNA损伤的影响。[方法]生长良好的L-02细胞,分别加入0.001、0.01、0.1μmol/L的DDT,0.01、0.1、1μg/mL的nano-TiO2,以及上述各浓度的DDT和nano-TiO2联合剂量,染毒时间均为24 h;运用DCFH-DA作为荧光探针,采用流式细胞检测技术检测DDT与nano-TiO2联合作用下L-02细胞内ROS含量,运用碱性和中性两种彗星试验检测各组DNA断裂损伤程度。[结果]0.01μmol/L以上浓度组DDT单独作用24 h引起ROS升高（P〈0.05）和DNA损伤增加（P〈0.05）;各浓度nano-TiO2单独染毒均不能引起DNA损伤增加（P〉0.05）,但1μg/mL单独染毒可引起ROS升高（P〈0.05）。各剂量组单独染毒24 h后均无明显的DNA双链损伤（P〉0.05）,但可导致DNA单链断裂损伤。析因分析结合反应曲面模型显示两种受试物联合染毒可协同增加ROS水平与DNA损伤作用（P〈0.05）。[结论]DDT和nano-TiO2联合作用可协同增加各自对DNA单链断裂水平的影响,诱导产生ROS导致DNA损伤是DDT和nano-TiO2引起机体损伤的主要机制之一。