血清中淀粉样蛋白的酶联免疫吸附测定法

本文介绍一种酶联免疫吸附方法测定人血清中的淀粉样蛋白质(SAP)。材料和方法:血清样本(健康男性100例、女性50例)、鼠抗人SAP 血清、纯化SAP 抗体。酶免疫方法:用SAP 抗体包被ELISA 反应板同时标记辣根过氧化物酶。包被液和洗液用pH7.4的磷酸缓冲液;用此液稀释样本、标准及标记抗体时需每升中加入牛血清白蛋白10g。向96孔微量反应板孔中加入100μl 磷酸缓冲液及20∶ng/L 的SAP 抗体,25℃温育16～18小时后甩干,用洗液洗四次。加入100μl 的稀释抗原,37℃温育2小时,冲洗。然后加入100μl 的标记抗体37℃温育2小时,冲洗反应板孔,最后加入100μl 的次酚     

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)检测轮状病毒抗原及其中和抗体

病毒酶联细胞免疫试验(VELCIA)不仅能检出和滴定适应株或野毒株轮状病毒,还能测定血清中的抗轮状病毒总抗体和中和抗体。具体方法如下:MA-104细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液悬浮成10~6细胞/ml,加50μl/孔至聚苯乙烯96孔板上,37℃孵育48-72小时长成单层细胞。粪便标本用PBS制成20%悬液,离心后取上清与等量含30μl/ml胰酶的MEM混合,37℃活化90分钟后,50μl/孔接种在MEM洗过3次的微孔板单层细胞上,室温吸附60分钟,倾弃样本,用MEM洗板上细胞3次,置于100μl/孔MEM孵育18-20小时。猪轮状病毒OSU株接种用含30μl/ml胰酶的MEM作一系列10倍稀释,活化60分钟,接种于MEM洗过3次的单层细胞上,37℃孵育48小时。然后用预冷至-20℃,85%丙酮固定不超过24小时,倾弃丙酮,自然干燥,用前及每次温育间均用含0.05%吐温20的盐水洗3—5次。VELCIA检测轮状病毒抗原时,每孔加50μl1/200稀释的猪抗轮状病毒过氧化物酶结合物37℃温育2小时,随即加100μl/孔ABTS底物(2.2-叠氮-3-二乙基苯噻唑磺酸)作用1小时后,将80μl     

用ELISA定量测定人血清载脂蛋白A-1

血清高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白apoA-1的定量测定在临床上具有重要意义。apoA-1的定量测定常用放射免疫法、免疫电泳法和免疫浊度法。本文作者用ELISA[一种“三明治”式酶联免疫法)定量测定人血清apoA-1,具有灵敏度高、抗体用量少、避免放射性、样本处理能力大等优点。本法所用的兔抗人apoA-1抗体均经亲和层折法纯化。聚乙烯酶标板先用纯化apoA-1抗体包被,37℃保温3小时后于4℃放置过夜;倒去包被液后用洗涤液洗涤三次,加入100μl适当稀释的标准apoA-1或待测血清样本,37℃保温2小时;倒去样本液并洗涤5次,加入100μl辣根过氧化物酶标记的纯化apoA-1抗体,置37℃保温2小时后,再次倒去抗体并如前洗涤。最后加入100μl酶反应     

一种检测TgA缺乏的快速筛选试验

本文介绍筛选IgA缺乏的一种快速固相红细胞吸附试验(SPRCA)。方法:用蒸镏水稀释亲和纯化羊抗人IgA 至20μg/ml.然后取100μl 加于聚苯乙烯U型孔底微量反应板孔内.置37C 孵育4小时后保存于4℃备用。试验前反应板孔用0.85%生理盐水洗5次,加1滴被检血清包被反应孔,置37℃孵育5■,再用0.85%盐水洗5次,于每孔加1滴IgA 致敏指示红细胞,600×g 离心(?),观察反应结果。指示红细胞全部或部分复盖在孔的表面为阳性(IgA 水平<1mg/dl),红细胞形成小而分散扣于孔底为阴性(IgA水平>1mg/dl)。22例住院病人血清先用比浊法确定样本IgA水平,再将每份血清样本用6%白蛋白稀释成IgA     

用亲和素-生物素-免疫酶法(NABA)检测溶菌酶

本法可用于测定正常人和急性髓样白血病患者血清中的溶菌酶,步骤如下:用抗溶菌酶抗体(15μg/ml)包被微孔板,置4℃过夜后洗涤。加样品(100μl),置37℃1小时。经洗涤后加生物素化抗溶菌酶抗体(100μl,1:500),同法温育并洗涤。加酶标亲和素(1mg/ml 原液经1:2000稀释,每孔加100μl),置室温10分钟。洗涤,加底物,置室温10分钟终止反应。若采用快速法,加样品、生物素化抗体、酶标亲和素及底物后的温育时间应分别缩短为20分钟、20分钟、5分钟和5分钟。同时以竞争性亲和素-生物素-免疫酶测定法作对比。竞争     

检测疟原虫穿透性的新方法——双染色法

为了解孢子体与肝细胞相互作用的情况,作者报道1种新的检查方法——酶联免疫和免疫荧光双染色测定法来鉴定孢子体是寄生于肝细胞膜表面,还是侵入肝细胞内。该法首先将有代谢功能的肝细胞体外培养,再接种一定量的疟原虫孢子体继续培养数小时使其感染,然后用这些培养物分二步进行染色观察。第1步酶联免疫测定:培养物洗3次——4%聚甲醛固定5分钟孢子体表面抗原单克隆抗体37℃孵育30分钟——洗3次——过氧化物酶标记的第2抗体(羊抗鼠Ig)洗3次加底物显色——洗3次——无水乙醇处理20分钟——洗3次——置37℃过夜。第2步免疫荧光测定:次日将上述处理的培养物洗3次——单克隆抗体孵育洗3次——荧光     

固相LISS扰球蛋白试验检测红细胞抗体

固相低离子强度溶液抗球蛋白试验(LISS-SPAT)已经用在粘附有固相干燥血清的微量板上。本文作者就这一新技术的方法、结果作了详细介绍。方法:①粘附过程:AB型混合血清来自10名无输血史的男性献血员,其中加入热聚集的人免疫球蛋白以激活补体系统,然后取80μl用磷酸盐缓冲液(PBS)作1∶5稀释后,加到U型聚苯乙烯微量板孔里,4℃孵育24小时。然后以PBS冲洗微量板3次,再把微量板置37℃干燥2小时。经上述处理后,粘附血清的微量板可放4℃保存1月。②红细胞(RBC)的制备:浓度为0.05%的RBC 150μl,加入未经处理的聚苯乙烯U型微量板孔底,可在4℃保存1周。③     

斑点免疫结合法测定卵黄抗体的活性

背景:哺乳动物产生的抗体和鸡产生的卵黄抗体在物理、生物活性方面存在差异。卵黄抗体能耐酸耐热,可口服用来防治动物和人类的肠内感染疾病,且对发展常规的诊断免疫实验有益。传统的ELISA法检测卵黄抗体比斑点免疫结合法费时。目的:应用斑点免疫结合法检测卵黄抗体的稳定性。设计:开放性实验。单位:解放军成都军区昆明总医院输血科。材料:实验于2006-01/06在解放军成都军区昆明总医院完成。选取30周龄的白色莱杭母鸡2只,以HLA-A*0201α链作为抗原,纯化抗原的总蛋白浓度0.04g/L,相对分子质量为32000(自行制备);硝酸纤维素膜(进口分装);脱脂奶粉(安怡产品,批号20051220);DAB(博士德公司);辛酸(上海星火化工厂生产);硫酸铵(汕头市光华化学厂生产)。方法:①抗原HLA-A*0201α链以总蛋白浓度0.04g/L纯化后,进行鸡卵黄抗体的纯化,采用SDS-PAGE电泳检测卵黄抗体的纯化结果。②1μL抗原被点样在硝酸纤维素膜的中心,于37℃孵箱中烤干,浸于1mL的PBST中,37℃孵箱90r/min封闭振荡15min,重新更换1mL的PBST,加入一抗卵黄抗体,终浓度为10mg/L。在37℃孵箱振荡30min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次。加入二抗标记HRP的鼠抗鸡卵黄抗体,孵育30min后,硝酸纤维素膜用PBST洗3次,通过用DAB试剂孵育来显色。阳性反应产生一个深棕色的斑点,表明卵黄抗体具有较好的活性;斑点变浅表明失去部分活性;斑点消失表明失去全部活性。根据斑点的灰度值变化对照标准样品,可计算卵黄抗体剩余的百分活性。③卵黄抗体用磷酸盐缓冲液调整为1,0.1,0.01g/L3种蛋白浓度,室温下放置4个月,每个月分别从各种浓度的样品中取10μg,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体室温稳定性。④卵黄抗体分别置于7个EP管,100μL/管,编号1～7。1～3号管用1mol/L的HCL分别调整pH值为5,3,2;4～6号管用1mol/L的NaOH分别调整pH值为9,11,12;7号管的pH值为7(中性),不加酸或碱。1～7号管均放在37℃孵箱中3h,每隔1h各管分别取10μg样品,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体不同pH值条件下的稳定性。⑤卵黄抗体分别置于6个EP管,10μL/管,编号1～6。按顺序编号各管分别于30,40,50,60,70,80℃水浴15min,然后4℃冰箱冷却,每管取样10μg,以未经过加热处理的样品作为标准对照,采用斑点免疫结合法检测卵黄抗体热稳定性。主要观察指标:①卵黄抗体SDS-PAGE电泳检测。②卵黄抗体室温稳定性检测。③卵黄抗体不同pH值稳定性检测结果。④卵黄抗体热稳定性检测。结果:①纯化的卵黄抗体经SDS-PAGE电泳后有两条主带,重链相对分子质量约66000,轻链相对分子质量约25000。②1,0.1,0.01g/L的卵黄抗体,室温下放置4个月后仍然保留部分活性。③pH5～9时37℃孵育3h后,卵黄抗体仍有部分活性;在pH低于5或高于9的条件下37℃孵育3h后,卵黄抗体失去全部活性。④纯化的卵黄抗体分别置于6个EP管中,1～4号管的卵黄抗体仍有活性,第5管和第6管出现白色沉淀,可能是较高温度下蛋白变性引起的。结论:卵黄抗体稳定性较好,斑点免疫结合法能够快速简单的证明和描述卵黄抗体的功能活性,且只需要微量抗原和抗体,斑点特异,能同时处理大量样品。     

一种使用抗RhD单抗测定临床用免疫球蛋白制品抗-D能力的竞争性放射免疫测定法

作者建立了一种使用单克隆抗-D的竞争性放射免疫测定法,利用标记的抗-D单抗和未标记的抗-D制品竞争结合抗原,从而测定预防用免疫球蛋白制品的抗-D能力。采用三种人单克隆抗-DFog-1,Brad-3和Brad-5作为~(125)I标记标准,对多种抗-D制品进行了检测,并将检测结果与自动分析法进行了比较。 首先需通过红细胞稀释曲线求得放射免疫法(RIA)中应采用的红细胞浓度。以确保一定抗原浓度。红细胞以1:1为起始浓度,进行5倍连续稀释,将110μl各稀释度的红细胞分别与10μl~(125)I标记的单克隆抗-D于37℃孵育1小时,洗涤。离心后,用γ-计数器测定结合到细胞上的放射活性,以结合的放射百分数对     

选择性供血人群中巴贝虫抗体的检测

人类巴贝虫病(Babesiosis)能通过输注被感染的献血者的红细胞、血小板等血液成份而传播。作者用直接荧光免疫抗体分析法(IFA),以巴贝虫为抗原检测巴贝虫抗体。方法:在抗原板的12个孔内加入被巴贝虫感染的红细胞悬液,干燥,甲醇固定。被检血清在试验前作1∶16稀释,加在抗原板孔内,37℃孵育30分钟,以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,室温干燥,然后每孔加荧光标记的抗人IgG,再于37℃温度中孵育30分钟,PBS再洗涤3次,室温干燥,加入甘油,盖上玻片检查。结果:Cape Cod检查779例供血者血清中巴贝虫抗体,29例阳性,占3.7%,其中男性17例,女性12例,年龄为20 59岁;在波士顿检     

测定β_2—糖蛋白Ⅰ的ELISA法

β_2—糖蛋白Ⅰ的检测是肾小管损害的一个新的指标,本文作者认为以前的辐射状单向琼扩法对于健康人及轻微肾小管损害病人尿的检测缺乏灵敏性,因此建立了ELISA 法。方法:收集健康志愿者和各种不同肾损害病人的血清及随机尿标本(4小时内收集、不加防腐剂)保存于-20℃、-25℃条件下。1.用1∶500稀释的兔抗β_2—糖蛋白Ⅰ抗体包被微孔板,每孔加100ul室温,暗处放置2～6h。2.用洗液(含10g/LNaCl、1ml/L 吐温-20去离子水)洗板10次,每次200μl。     

伤寒血清学诊断的一种简易的杀菌抗体试验

本文报道一种简易杀菌抗体测定法,可用于伤寒血清学诊断.该试验对Kenny(1967)法略加改进.待检血清用pH7.2磷酸盐缓冲盐水作倍量稀释,从1/10至1/2560.取每份稀释血清0.025毫升加入微孔板,加等量1∶10豚鼠补体及10~4个细菌/毫升伤寒沙门氏菌悬液.适当混和后,微孔板用胶布覆盖,置37℃孵育1小时.然后每孔取10微升接种于琼脂平板,经37℃孵育18小时作菌落计数.杀菌活性以杀灭菌液内50%细菌所需血清稀释度的倒数表示.对照孔加补体,不加血清.杀菌抗体血清标本取自24例急性期伤寒病人(其中13例尚取恢复期血清),15例临床可疑病人及23名正常人作为对照,并与肥达氏试验比较.杀菌抗体效价如以≥1∶80作为阳性,则24例急性期血清和13例恢复期血清杀菌抗体均属阳性;15例临床可     

用ELISA(方法)测定血清淀粉样蛋白P

血清淀粉样蛋白P(SAP)呈糖基化(蛋白),在血清中以两个五聚圆盆状的复合体存在。SAP 由肝脏合成,半衰期为7.8～8.5小时,说明SAP 产生快速而持续以维持血清中稳定浓度在40～50mg/L。为更好了解SAP 的功能,需要快速的测定方法。本文介绍ELISA 测定人SAP 浓度。方法如下:用经蛋白A 层析柱和SAP(琼脂糖CL-4B 柱纯化的抗SAP 包被。同一抗体用辣根过氧化物酶标记作为二抗。反应板每孔中加100μl抗SAP 抗体(20mg/L)溶液,放25℃16～18小时,递经洗涤加100μl 受检标本温育洗涤后,加100μl 标记抗体,按常规洗涤,于492nm 波长读取吸光度。本法从混合人血清分离出的SAP 的纯度>     

用直接酶免疫技术测定风疹病毒IgG

作者介绍一种新的固相酶免疫技术(EIA)以检测风疹病毒特异性IgG用辣根过氧化物酶(HRPO)标记半纯化风疹病毒抗原。半纯化抗原制备的方法是在Halone和Meurman法的基础上加以改进而来的:在700cm~2旋转瓶中,以含5?S、5%TPB、10μg/ml庆大霉素的199营养液培养Vero细胞4-5天后,弃去营养液,用BME(其中加入4%F-CS,5%TPB、1%精氨酸、10μg/ml庆大霉素)将约10~(-7)感染温度的Therien风疹病毒稀释至1:1000,以稀释的风疹病毒20ml加入各管,置35℃1.5小时     

使用亚特斯全自动酶免系统检测HCV抗体试剂盒的评估报告

亚特斯Personal LAB全自动酶免分析仪(简称PLAB)和Nexgen Four全自动酶免分析仪(简称Nexgen Four)由意大利亚特斯公司(Adaltis Inc.)开发、生产和销售.这2款仪器为开放式仪器,可自动化完成酶联免疫吸附试验(enzy-linked immunosorbent assay,ELISA),其自动操作过程与ELISA常规手工操作步骤基本相同,因而自动化操作可靠.PLAB和Nexgen Four的重要操作步骤包括:(1)预稀释样本,单次最高稀释倍数可至1/101,可进行连续倍比稀释;(2)移液量(10～200μl);(3)孵育温度室温至50℃孵育;(4)整板或逐条洗涤酶标板;(5)在波长400～700nm范围内读取吸光度(A)值.     

ELISA法检测抗脑磷脂抗体及其临床意义

本文应用脑磷脂(Sigma公司)为抗原,用ELISA法检查血浆中的抗脑磷脂抗体。通过优选试验条件确定适当抗原包被浓度为10.0μg/ml,血清稀释度1:20,酶标板应用1%硫酸鱼精蛋白预处理,包被后只洗一次。用此法检查65例正常人,阳性率为3.1%,脑萎缩患者的血清阳性率为66.6%,缺血性脑血管病27.4%,脑出血20.0%,一过性脑缺血发作10.0%。表明此种抗体阳性与脑血栓形成有明显联系,阳性患者中78.6%有血流变学检查的异常。     

竞争性酶免疫法检测人布鲁氏杆菌

检测布鲁氏杆菌常用的血清学方法为凝集实验和补体结合实验 ( CFT) ,其准确性和灵敏度有待提高 ,间接酶联免疫实验灵敏度高 ,但易产生假阳性 ,且试剂的标准化较困难。本文介绍一种快速、简便 ,灵敏度高 ,特异性好的竞争性酶免疫法 ( CELISA)。方法　布鲁氏杆菌 S-LPS抗原用 0 .0 6mol/L Na H-CO3缓冲液 ( p H 9.6)稀释后 ,反应板每孔加 1 0 0μl,4℃过夜 ( 1 8h)包被。用含 0 .0 5% Tween-2 0的 0 .0 1 mol/L磷酸盐缓冲液 ( p H 7.2 )洗涤 4次 ,加入 95μl鼠单克隆抗体 (用含 0 .0 1 5mol/L EDTA-EGTA的 PBS液稀释 ) ,再加 5…     

微量全血ELISA检测HBsAg

一、操作:在4×10孔聚苯乙烯反应板的每孔中,加用包被液稀释的抗HBsAg200μl,40℃置24小时后倾去包被液,用洗涤液洗三次.每孔加稀释液(pH7.4,0.02MPBS:内含0.1g/dl EDTANa_2,     

用单克隆抗个体基因型抗体诊断砂眼衣原体感染

砂眼衣原体感染已成为世界范围内流行的性传播性疾病,提供有效的实验室诊断极为重要。作者介绍了一种实验室诊断砂眼衣原体的抗个体基因型新方法(Ab_1—Ab_2EIA法),它具有现行EIA的优点,且特异性很高,无须确证试验。其原理为:用鼠抗砂眼衣原体60KDa热休克蛋白(HSP60)的特异性表型的抗体Ab_1(GP57-21)与针对此抗体的单克隆抗基因型抗体Ab_2(α21-A-D)。Ab_1与Ab_2亲合力很高,如标本中存有砂眼衣原体抗原则可抑制Ab_1—Ab_2,抗体的结合。试验采用抑制性和竞争性两种EIA:抑制性EIA法,将纯化MAb_1的F(ab~1)_2片段0.1μg/孔包被微孔板,加入0.5％BSA/PBS的抗原稀释液,37℃lh后,加入MAb_2室温下反应30’,用PBS/Tween洗后加入碱磷酶标记的抗鼠IgGFc段,     

ABC—ELISA用于疟疾现场血清学检测

由于血涂片显微镜观察诊断疟疾的方法可能遗漏那些低疟原虫血症的患者,本文介绍一种检测血疟原虫抗体的新血清学方法(ABC—ELISA)。其主要步骤为:1.抗原制备:收集体外培养的疟原虫感染占20%以上的RBC,混匀,以0.45%NaCl 溶血后,置0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液作声波处理,再以该缓冲液稀释终蛋白浓度为250μg/ml 的抗原液备用或冻干贮存。2.抗原包被及处理:在96孔U 型微量滴定板内,每孔加20μl 抗原液,37℃过夜、干燥、PBS 洗涤后,每孔加50μl0.5%高碘酸作用10min 以抑制抗原内的过氧化物酶活性,之后,每孔再加50μl 含2%正常羊血清的PBS(PBS-GS),置37℃作用30min,以防止免疫球蛋白的非特异性结合。3.加待检血清:每