溶栓素的纯化研究

目的 :研究溶栓素的纯化工艺。方法 :采用超滤法截留分离 ,强阴离子交换层析去除核酸 ,弱阴/阳离子交换层析和疏水层析组合法精细分离溶栓素。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色法结合显示最终纯化产物为一条染色带 ,纯化倍数为 144 .83,回收率为 38.6 6 %。结论 :溶栓素的纯化工艺基本体现了工业生产工艺的特点 ,具有一定的实用性。     

发酵液中重组水蛭素的分离纯化

目的：建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法：高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外，发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白；采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果：纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带，重组水蛭素比活性为6000ATU／mg，纯化收率达38．6％。结论：超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化工艺建立

目的 建立大肠杆菌高密度表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(STH)分离纯化工艺.方法 高密度培养重组大肠杆菌并诱导表达STH,离心收集菌体,反复冻融后收集上清液经超滤、两步阴离子交换层析,分离纯化STH目的 蛋白.结果 纯化后的STH纯度为98%以上,纤溶比活性2.6×104IU/mg,活性回收率56%.结论 建立了STH的纯化工艺,该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产.     

孕妇血清中早孕因子的分离与纯化

目的：建立一条从妊娠早期妇女血清中分离纯化早孕因子的技术路线，获得高纯度的早孕因子。方法：采用依次经过DEAE 52阴离子交换层析、SP Sepharose F．F阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl-6B亲和层析分离纯化的方案，最终得到具有早孕因子活性的Heparin-Ⅱ成分，早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有一条电泳区带，相对分子量为10．91kDa。结论：这条分离纯化早孕因子的技术路线是可行的，得到的相对分子量为10．91kDa的蛋白质为电泳纯的早孕因子。     

重组水蛭素Ⅲ的分离纯化与鉴定

目的：从分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌发酵液中分离纯化水蛭素Ⅲ?方法：将发酵液经离心、大孔吸附树脂处理后，用DEAE-cellulose DE52离子交换层析，进而用HPLC反相层析。结果：总收率达50％以上，纯度达99．9％，比活力达9000ATU／mg。结论：分离纯化系统令人满意，回收率较高。     

亲和层析法纯化溶栓素

目的 :探讨亲和层析纯化溶栓素的方法。方法 :采用高碘酸钠法制备溶栓素抗体的亲和层析介质纯化溶栓素。结果 :提纯的溶栓素经聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE)鉴定为一条带 ,活性回收率为 49.5 %。结论 :亲和层析的高碘酸钠法是纯化溶栓素的一种分离速度快、特异性强、经济、安全可靠的方法 ,并适合于大规模纯化     

重组人瘦素的分离纯化

目的：探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法。方法：采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfast flow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fast flow)在pH7．5的条件下进行纯化。结果：经Q柱一步纯化后，产物纯度由42．3％到达89．6％，随后通过疏水层析纯化后，产物纯度达到96．2％。经SDS—PAGE证实为单一蛋白条带。结论：通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素。     

用Streamline SP从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HBsAg Fab最适吸附条件的选择及验证

目的 选择阳离子交换介质Streamline SP分离纯化anti-HBsAgFab的最适吸附条件。方法试管法分别测定平衡缓冲液在不同DH和不同离子强度下,阳离子交换介质Streamline SP对预分离纯化蛋白的吸附效果。用l mlSP预装柱及自装28 ml Streamline SP柱进行离子交换层析以验证吸附效果。结果NaAc-HAc作为平衡缓冲液在pH4．4、离子强度100-600mmlo/L可以使阳离子交换介质Streamline SP与蛋白吸附达到最佳效果。在该条件下用l ml SP预装柱及自装28ml SP柱进行离子交换层析,均验证了这一吸附效果。结论试管法选择的离子交换层析的最适吸附条件用于从大肠杆菌中初步分离纯化anti-HbsAg Fab切实可行。     

大肠杆菌表达的rhIL—8的分离纯化

目的：探索人重组白细胞介素－８（ｒｈＩＬ－８）的分离纯化的路线。方法：用Ｓｅｐｈａｃｒｙ１－Ｓ－２００凝胶过滤和ＷＱｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｉｇ ｂｅａｄｓ两步连续阴郭交换层析纯化，结果：两种方法纯化的ｒｈＩＬ－８纯度分别达９５．６％、９８．６％。氨基酸组份分析推算值基本与理论值相符。纯化的ｒｈＩＬ－８对小 人中性粒细胞具有明显的体内体外趋势     

大肠杆菌表达的rhIL－8的分离纯化

目的：探索人重组白细胞介素－８（ｒｈＩＬ－８）的分离纯化的路线。方法：用Ｓｅｐｈａｃｒｙ１－Ｓ－２００凝胶过滤和Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｂｉｇｈｅａｄｘ两步连续阴离子交换层析纯化。结果：两种方法纯化的ｒｈＩＬ－８纯度分别达９５．６％、９８．６％。氨基酸组份分析推算值基本与理论值相符。纯化的ｒｈＩＬ－８对小鼠和人中性粒细胞具有明显的体内体外趋化作用。结论：本法为ｒｈｌＬ－８提供了快速高效的纯化路线。     

孕血清中早孕因子的分离纯化

目的:通过离子交换层析和亲和层析的分离方法从孕血清中得到纯化的早孕因子(EPF),为进一步制备单克隆抗体做准备。方法:采用依次经过DEAE52阴离子交换层析,SP Sepharose F.F阳离子交换层析,Con ASepharose4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl6B亲和层析分离纯化方案,最终得到具有早孕因子活性的Hepa-rin-Ⅱ成分,早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条带,相对分子量分别为46.30kDa和10.71kDa。结论:经过四步层析得到较纯的EPF样品,并认为EPF在血清中可以以单体和多聚体形式存在。     

对一种源于蜗牛的壳聚糖水解酶的不同纯化方法的选择

目的研究源于蜗牛的壳聚糖水解酶的纯化方法，得到壳聚糖水解酶的纯品，从而为氨基酸序列分析、基因克隆及工业菌制备奠定前期基础。方法对比疏水作用层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱（HA）层析、凝胶过滤层析等方法纯化蜗牛酶的实际效果，确定纯化的最佳条件，从而设计出最合理的纯化方案。结果分别用苯基琼脂糖柱层析，DEAE—Sepharose离子交换层析，羟基磷灰石柱层析，Sephacryl S-300凝胶过滤层析分离蜗牛酶，最终确定为用弱阴离子交换填料DEAD—Sepharose，疏水作用层析，凝胶过滤层析进行分离。结论本文探讨了蜗牛酶的不同纯化方法，建立了一种从蜗牛酶中分离高效高纯度壳聚糖水解酶的方法，为壳寡糖的酶解工业生产提供了新方法。     

幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌BIB发酵及纯化工艺研究

目的初步建立重组幽门螺杆菌多靶点疫苗工程菌（BIB）的高密度发酵及其蛋白纯化工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,放大工艺至50L发酵罐中,对影响目的蛋白收率的因素如发酵培养基、工作种子接种量、诱导剂浓度、诱导起始时间、诱导持续时间及诱导剂添加方式等进行优化验证;并利用rBIB蛋白高等电点特性（pI=9.05）,在pH 7.0-7.5的磷酸盐缓冲液中目的蛋白带正电荷,采用阳离子交换层析进行纯化,对阳离子交换层析填料及纯化缓冲液的pH进行优化。结果经高密度发酵后BIB菌体产量为70g/L,蛋白表达量为32%;rBIB蛋白经阳离子交换层析纯化后其纯度为91.8%。结论该工艺的初步建立为深入研究rBIB蛋白性质及其规模化生产奠定了基础。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

人肝癌组织特异性γ-谷氨酰转移酶分离纯化

目的:分离纯化人肝癌组织中特异性γ-谷氨酰转移酶(GGT),为进一步制备其抗血清提供抗原材料,以便对肝癌早期诊断进行研究。方法:人肝癌组织经匀浆、离心、溶解、透析、凝胶层析及凝集素亲和层析等步骤进行分离纯化;纯化过程用IFCC推荐方法监测GGT催化活性,紫外法监测蛋白质出峰图谱,Lowry法测定蛋白含量。结果:经过粗提、DEAE阴离子交换层析、凝胶过滤层析及凝集素亲和层析等纯化步骤得到电泳纯的GGT,其比活为10.58U/mg蛋白,纯化倍数为84.9,得率为1.60%。结论:该方法能够较好地分离纯化人肝癌组织中特异性GGT。     

重组人内皮抑素层析复性的相关研究

研究了由大肠杆菌表达的重组人内皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的复性、纯化过程.比较先层析复性后纯化(工艺1)和先纯化后层析复性(工艺2)两种工艺的结果表明:工艺1所得rhES的收率和活性回收率分别为64.44%和213.19%,与工艺2相比分别提高8.70%和33.04%.工艺1中,研究了3种凝胶过滤柱复性及复性pH和上样蛋白浓度对复性的影响,并优化相关工艺.结果表明:在pH9.0,rhES浓度3.91 mg/mL的条件下,采用双梯度凝胶过滤Sephacryl S-100 HR进行层析复性,Sephadex G-25脱盐后,用SP Sepharose FF阳离子交换吸附纯化,获得活性回收率为213.19%,HPLC纯度为97.07%的rhES,其IC50为1.58 ug/mL.     

阴沟肠杆菌Ampc酶的分离纯化

目的：分离纯化Ampc酶并对酶的理化特性进行相关研究。方法：运用离子层析等技术对酶分离纯化；运用电泳等技术研究理化特性。结果：获得纯品酶并证实为Ampc酶。结论：本实验所采用的分离纯化技术可获得纯品Ampc酶。     

重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定

目的利用大肠杆菌表达载体,表达血红蛋白(Hb)基因,并进行纯化及鉴定。方法将原核表达载体pHE 2-Hb转化入E.Coli JM109,经IPTG诱导表达;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,用Western blot鉴定纯化出的目的蛋白。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量约为67 kD,与理论值相一致;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,Western blot检测表明得到纯度较高的目的蛋白。结论利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究Hb的生物传氧机制研究和以Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。     

虎血清免疫球蛋白(IgG)的纯化及纯度、活性鉴定

目的建立高纯度、高活性的虎血清IgG纯化方法。方法用饱和硫酸铵沉淀虎血清得到IgG粗品;结合Hitrap Protein A亲和层析预装柱及阴离子交换层析法对粗品IgG进一步分离纯化,采用PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果80 mL虎血清亲和纯化得到84 mg IgG,阴离子交换层析纯化得到30 mg虎的IgG纯品。结论建立了简便快速、纯度高、活性好的虎血清IgG的分离纯化方法,为虎血清IgG二级抗体的制备提供了高纯度、活性好的一级抗体免疫原。     

南蛇藤中扁蒴藤素提取分离工艺研究

目的对南蛇藤中扁蒴藤素提取纯化工艺进行研究。方法南蛇藤根粉经丙酮冷浸提取后,采用聚酰胺柱层析及硅胶柱层析进行分离纯化;以HPLC法测定产品中扁蒴藤素的含量,并以其为指标对分离纯化的主要工艺参数进行优化。结果将待分离的南蛇藤丙酮浸膏和聚酰胺（60～100目）按物料比0．02（质量比）装入层析柱中,常压下用体积分数75％的甲醇洗脱至洗脱液近无色,收集流分,浓缩后得到粗品,经硅胶柱层析进一步纯化,再经重结晶后纯度提高到98．0％以上。结论该工艺简单、成本较低,适于工业化。