eIF-5A的亚细胞定位研究

目的：研究eIF-5A的亚细胞定位,为了解其生物学功能提供线索。方法：借助免疫荧光技术和GFP标签技术,用激光共聚焦显微镜检测eIF-5A的亚细胞定位。结果：免疫荧光检测结果表明,eIF-5A定位于细胞质中;GFP-5A瞬时转染后,起初eIF-5A为全细胞分布,以后逐渐转移到细胞质中。第50位赖氨酸突变为丙氨酸后的eIF-5A则分布于整个细胞。结论：eIF-5A具有核质穿梭功能,它的亚细胞定位是个动态变化过程,hypusine可影响其亚细胞定位,进而可能影响其功能的发挥。     

真核生物翻译起始因子5A的结构与功能研究进展

真核生物翻译起始因子5A（eIF5A）是公认的维持细胞活性必不可少的翻译起始因子,其序列从古细菌到哺乳动物都是高度保守的。eIF5A是唯一的发生依赖多胺精胺翻译后修饰[生物学上称为羟腐胺赖氨酸作用（hy-pusination）过程]的真核生物细胞内蛋白质。本文主要着眼于eIF5A的结构特征和生物学功能,综述了eIF5A和hypusination在各种组织中控制细胞循环和凋亡的过程及eIF5A最新的研究结果。     

血清载脂蛋白A5与糖尿病肾病关系探讨

目的：探讨血清载脂蛋白A5（ ApoA5）水平与糖尿病肾病患者之间关系。方法选取198例糖尿病患者,分为糖尿病肾病组86例,糖尿病不伴肾病组112例;另选取120名健康体检者作为对照组。采用ELISA法测定ApoA5水平,并进行相关性分析。结果糖尿病肾病组血清ApoA5水平低于糖尿病不伴肾病组,又都低于健康对照组水平,三者间差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论血清ApoA5水平是糖尿病肾病的重要危险因素。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

白英水提物诱导人卵巢癌A2780细胞bcl-2基因表达的影响

目的：观察白英水提物诱导人卵巢癌A2780细胞凋亡的作用,初步探讨其分子机制。方法：常规方法制备白英水提物,体外培养人卵巢癌A2780细胞,MTT法提示其有较强的体外抑制A2780细胞作用。采用半定量RT—PCR法检测凋亡相关基因bcl-2表达。实验组设白英水提物12．5、25．0、50．0mg／ml 3种浓度,以顺铂（25．0μg／ml）为阳性对照组。结果：白英水提物对A2780细胞增殖有抑制作用,且呈明显的量效关系,半定量RT—PCR法检测显示bcl-2 mRNA表达下调,诱导其发生凋亡。结论：白英水提物对A2780细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用,其诱导A2780细胞凋亡的分子机制可能与下调bcl-2基因表达有关。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。     

补充支链氨基酸对划船运动员血液某些氨基酸浓度及血小板5-HT2A受体与螺环哌丁苯结合的影响

目的:观察补充支链氨基酸(BCAA)对划船运动员血液某些氨基酸浓度及血小板5-HT2A受体与螺环哌丁苯结合的影响,为运动员疲劳控制及合理营养补充提供实验依据.方法:18名男子划船运动员,随机分为安慰剂组、BCAA组及BCAA CHO组,补剂的同时进行2周大运动量训练,2周后的1次急性运动前后,采用放射标记受体测定技术,测定各组运动员血小板5-HT2A受体与[3H]Spiperone(螺环哌丁苯)结合的最大结合容量、平衡解离常数的变化;同时测定血液BCAA、游离色氨酸的含量并进行分析.结果:(1)血浆中几种氨基酸浓度的变化:男子划船运动员2周大运动量训练后的1次急性运动前,各组安静值均无显著性差异;运动后BCAA组及BCAA CHO组BCAA值与运动前相比显著提高.BCAA组和BCAA CHO组运动员运动后血液丙氨酸浓度显著升高(P<0.05).BCAA及BCAA CHO组1次急性运动后即刻,fTrp/BCAA比值与运动前相比均显著降低.(2)血小板5-HT2A受体与[3H]Spiperone(螺环哌丁苯)结合的最大结合容量及平衡解离常数的变化:男子划船运动员2周大运动量训练后的1次急性运动后,安慰剂组较BCAA组和BCAA CHO组最大结合容量下降更显著(P<0.05);BCAA组及BCAA CHO组的平衡解离常数显著降低(P<0.05).结论:2周大运动量训练期间补充BCAA或BCAA CHO对改善血液BCAA含量、fTrp/BCAA比率等某些外周以及中枢疲劳指标有一定作用.     

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响

目的 构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响.方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K.随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K.用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响.结果 酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K.流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P＜0.05),细胞凋亡率明显增高(P＜0.05).结论 含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡.     

HRAD17过表达促进辐射损伤诱导的A549细胞凋亡

目的 探讨HRAD17对辐射损伤诱导细胞凋亡的影响及其机制。方法 将HRAD17转染人肺癌细胞A549经⁶⁰Co γ射线照射后观察细胞凋亡变化。用Western blot 检测凋亡相关基因表达水平,RT-PCR检测凋亡相关基因转录水平。结果 HRAD17转染可促进γ射线诱导的细胞凋亡。与对照组相比,HRAD17转染组p53蛋白Ser 46磷酸化和p53 AIP1基因转录明显增强。结论 HRAD17可促进辐射损伤诱导的细胞凋亡, 其部分机制可能是通过提高p53 AIP1的表达来实现的。     

沸石5A分子筛吸附乘员舱CO2性能分析

目的 分析沸石5A分子筛吸附乘员舱CO<,2>的性能.方法 采用Origin软件对沸石5A分子筛吸附CO<,2>、N<,2>以及O<,2>的实验数据与Langmuir,Freundlich及BET等温吸附方程式的适配性进行拟合分析,结合混合气体竞争吸附理论,计算竞争吸附情况下3种气体的吸附量.结果 获得了适用方程的相关常数,计算出了竞争吸附下3种气体的吸附量.结论 N<,2>在吸附过程中将对CO<,2>的吸附产生较大影响,可考虑适当改进分子筛,使其将N<,2>的影响降到最低.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

中国汉族人群SCN5A基因H558R、P1090L、4299+53T＞C及D1819D的多态性研究

目的了解中国汉族人群SCN5A基因单核苷酸多态性少见等位基因频率分布情况。方法在社区体检人群中选择126例作为研究对象,采用限制性片段长度多态性分析（RFLP）对SCN5A基因的H558R、P1090L、4299＋53T〉C及CA457T（D1819D）多态位点进行基因型鉴定,并随机选取样本采用ABI3700毛细血管电泳进行序列测定验证酶切结果。结果SCN5A H558R、P1090L、4299＋53T〉C及C5457T（D1819D）在中国汉族人群中的少见等位基因频率分别为11．1％、5．2％、28．2％及31．8％,与日本及国人先前的研究结果不尽相同。结论SCN5A基因的单核苷酸多态性存在种族差异。     

Synthesis and autoradiographic evaluation of a novel high-affinity Tc-99m ligand for the 5-HT2A receptor

The synthesis and in vitro autoradiography of a novel Tc-99m ligand with subnanomolar affinity to the 5-HT_2A receptor is reported. The complex combines the 4-(4-fluoro)-benzoyl piperidine portion derived from the 5-HT_2A receptor antagonist ketanserin with a neutral oxotechnetium(V) chelate in form of a mixed ligand “3+1” unit containing the SNS/S donor set. The analogous rhenium compound has been synthesized as a surrogate for the Tc-99m complex for use in receptor binding assays and for complete structural characterization. In competition experiments the Tc-99 complex as well as its Re analogue display subnanomolar affinity toward the 5-HT_2A receptor (K_i 0.44 nM for Tc, 0.25 nM for Re). The subnanomolar 5-HT_2A receptor binding of the Re complex was confirmed by functional in vitro antagonism of contractile effects evoked by 5-HT in rat arterial tissue. Re 1 inhibited 5-HT-induced, 5-HT_2A receptor-mediated contractions of isolated rat tail artery in a competitive fashion and possessed nanomolar affinity ( pA₂=9.08, pA₂ representing the negative decadic logarithm of the Re 1/5-HT_2A-receptor dissociation constant [mol/L]). Like ketanserin, Re 1 displayed moderate affinity for adrenergic _1D ( pA₂=8.23) and histamine H₁ receptors ( pA₂=8.00), and was >600-fold up to 10,700-fold less active at several neurotransmitter receptor subtypes. In vitro autoradiographic studies clearly indicate the accumulation of the Tc-99m compound in 5-HT_2A-receptor-rich areas of the brain. This enrichment can be blocked by 5-HT_2A receptor antagonists such as mianserin and ketanserin and is therefore specific.     

123I-5-I-R91150, a new single-photon emission tomography ligand for 5-HT2A receptors: influence of age and gender in healthy subjects

5-HT_2A receptors have been implicated in the pathophysiology of mood disorders and in the therapeutic effect of the so-called atypical antipsychotics. Recently, a new radioiodinated ligand with high affinity and selectivity for serotonin 5-HT_2A receptors, ¹²³iodinated 4-amino-N-1-[3-(4-fluorophenoxy)propyl]-4-methyl-4-piperidinyl] 5-iodo-2-methoxybenzamide (¹²³I-5-I-R91150), has been developed and has been shown to be suitable for single-photon emission tomography (SPET) imaging. In this study the influence of age and gender on the ligand binding was investigated in normal volunteers. One hundred and fifty MBq of ¹²³I-5-I-R91150 was administered to 26 normal volunteers (13 females and 13 males) with an age range of 23–60 years. SPET imaging was performed with a triple-headed gamma camera. For semi-quantitative analysis, ratios of ligand binding in different regions of interest to the binding in the cerebellum were calculated. Mean ratios of 1.7 were obtained. No gender difference was demonstrated. 5-HT_2A binding was shown to decline with age. Over an age range of 40 years a reduction in ligand binding of 42%±7% was found. These results are in agreement with in vitro and positron emission tomography findings of a decline in 5-HT_2A receptor binding with age. The findings confirm the suitability of ¹²³I-5-I-R91150 for SPET imaging of 5-HT_2A receptors, and highlight the necessity for age-matched controls in clinical studies. Received 21 March and in revised form 18 August 1998     

结直肠癌中同源异型盒基因（HOX）A5和B6表达的研究

目的研究结直肠癌中HOX A5和B6 mRNA和蛋白表达,以探讨HOX A5和B6与结直肠癌关系。方法运用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术检测100例结直肠癌和100例结直肠良性病变中HOX A5和B6 mRNA表达,免疫组织化学SP法检测HOX A5和B6蛋白表达。统计分析HOX A5和B6表达与结直肠癌患者年龄、肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移关系。结果①结直肠癌HOX A5和B6 mRNA表达明显低于良性结直肠病变（P〈0.01）;②结直肠癌中HOX A5和B6蛋白表达与良性结直肠病变相比明显减少或消失;③淋巴结转移阳性结直肠癌病例HOX A5和B6 mRNA表达和蛋白表达明显低于转移阴性组,两组间差异有统计学意义;④HOX A5和B6 mRNA和蛋白表达与结直肠癌患者临床分期有相关性（P〈0.05）;⑤HOX A5和B6 mRNA和蛋白表达与结直肠癌患者年龄、肿瘤大小无相关性（P〉0.05）。结论对结直肠癌患者的肿瘤活检标本测定HOX A5和B6的mRNA和蛋白表达,既可以早期诊断结直肠癌,还可以在手术前对结直肠癌患者是否有淋巴结转移和Dukes分期进行判断。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.