腺病毒重组绿色荧光蛋白转染兔脂肪干细胞的体外研究

目的 通过采用腺病毒重组绿色荧光蛋白(Ad-EGFP)转染连续培养的家兔脂肪组织来源基质干细胞(ADSCs),检测其转染效率、最佳标记时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法 选择8～12周龄健康新西兰大白兔6只,雌雄不限,体质量1.5～2.5kg;切取6只兔腹股沟皮下脂肪组织1～2ml,采用贴壁法行体外分离培养ADSCs;将获取的第4代ADSCs进行流式细胞术表型鉴定和不同MOI值Ad-EGFP基因转染,同时通过活力和增殖实验进行Ad-EGFP体外转染对ADSCs的影响研究.结果 6份标本均成功培养出兔ADSCs且生长良好,并均成功进行了Ad-EGFP基因转染.①原代细胞培养48h后可见细胞贴壁生长,其ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞,传代后细胞形态主要为长梭形.经1:2传代后细胞增殖速度明显加快,3d后细胞已长满培养瓶底后,即可传代.②ADSCs倍增时间约72h.③第4代的ADSC表型呈CD29+,CD34-,CD44+,CD106-,CD133-和HLA-DR-.④Ad-EGFP可成功转入ADSCs.24h可见绿色荧光,5d时荧光表达强度最强;ADSCs传代后仍有强荧光表达.当MOI值为0、10、20、30、50、100时,转染率分别为0,11.2%,25.8%,46.7%,95.3%,97.2%.⑤转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7、9、11d时,其细胞活力、增殖分化的差异均无统计学意义.结论 能大量从兔脂肪组织分离培养出基质干细胞;EGFP可成功转染ADSCs,其MOI值为50时较为理想.所以,腺病毒是较好的基因载体,而EGFP转染是一种较好的兔ADSCs标记方法.     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及增强型绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外转染的研究

目的探讨重组增强型绿色荧光蛋白基因腺相关病毒(AAV-EGFP)对细胞生物学行为的影响,为组织工程寻找一种理想的病毒载体及细胞示踪标记方法。方法采用全骨髓法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导细胞成骨转化,行细胞形态学检查、细胞表面抗原鉴定、碱性磷酸酶(ALP)染色及Von Kossa染色,评价细胞成骨情况。在此基础上转染AAV-EGFP,观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度,计算转染效率,确定转染的较佳感染复数(MOI)值,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV载体对细胞活性的影响。结果细胞扩增迅速、形态良好、纯度较高,经诱导后呈现明显的成骨改变。实验确定AAV转染细胞的较佳MOI值为1×10~5,以此值转染AAV-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达(＞8周),并可随细胞有丝分裂传至子代,可以满足示踪标记的需要,AAV转染效率高,对细胞活性影响小。结论AAV长期稳定表达目的基因,是一种理想的组织工程病毒载体；基于基因转染方法高效稳定表达EGFP,可作为种子细胞良好的示踪标记方法。     

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的：以重组腺病毒（Ad）为载体,将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）中,为MSCs体内示踪提供实验基础。方法：用全骨髓细胞贴壁法分离纯化小鼠MSCs并体外扩增、鉴定,以重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒（Ad-EGFP）转染,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染率,CCK-8法检测转染细胞的增殖活性。结果：转染后10h MSCs开始表达荧光,6～8天达高峰,转染率可达92.3%,28天仍有表达;转染细胞的增殖活性和未转染细胞无统计学差异。结论：Ad-EGFP能高效、安全的转染mMSCs。     

增强型绿色荧光蛋白转染活细胞效率的研究

目的 研究影响增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒表达系统转染活细胞效率的主要相关参数,建立一种稳定高效的活细胞EGFP标记技术.方法 培养、扩增携带EGFP逆转录病毒载体的包装细胞PGl3,分别于12h、24h、36 h和48 h收集病毒液,转染骨髓基质细胞(BMSCs),通过流式细胞仪和荧光显微镜检测不同时间点病毒转染效率.选择转染率最高时间点的病毒液,连续转染BMSCs两次,小剂量嘌呤霉素筛选6h,观察病毒转染率及细胞活力.再以上述方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),观察这种方法标记其他干细胞或成熟分化细胞的可行性.结果 根据流式细胞仪及荧光显微镜观察结果,24h收集的病毒液转染BMSCs效率最高(64.56±2.53)％,36 h次之(56.98±3.22)％,12 h(47.39+1.82)％与48 h(37.84±1.77)％相对较低.连续转染两次并经短暂筛选后,BMSCs转染率可达80％以上,且细胞活力不受影响.采用相同方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),转染率均能达到80％,且细胞形态、增殖能力均未见明显改变.结论 本实验建立了一种稳定高效的活细胞EGFP转染技术,为研究组织工程种子细胞的体内、外转归及细胞间相互作用提供了稳定且直观的检测手段.     

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒体外转染培养的血管内皮细胞及其表达

目的观察可分泌表达人降钙素基因相关肽(humancalcitoningene-relatedpeptide,hCGRP)重组腺相关病毒(rAAV)体外转染培养的血管内皮细胞(endothelialcellsofvessel,ECV)及其作用,探讨其应用于血管性勃起功能障碍基因治疗的可行性。方法分别以可分泌表达hCGRP的重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP、表达报告基因GFP中的重组腺相关病毒VssCMV-GFP和空病毒pssHGCMV体外转染培养的ECV细胞,采用斑点印迹试验检测培养基中的hCGRP,以放射免疫法检测转染细胞中的cAMP和cGMP水平,观察GFP和hCGRP的表达及其对ECV细胞的影响。结果腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入血管内皮细胞并稳定表达,VssHGCMV-hCGRP病毒组细胞中cAMP水平(45.74±3.45)nmol/L较pssHGCMV空病毒组(14.84±0.65)nmol/L和对照组(12.74±0.65)nmol/L明显高(P<0.01),并可在实验组24h细胞培养液中检测到免疫反应性hCGRP。结论可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在血管内皮细胞过表达,并可选择性刺激该细胞中cAMP水平升高,提示hCGRP可作为血管性勃起功能障碍基因治疗的有效候选基因。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

绿色荧光蛋白体外转染与体内示踪成骨细胞的研究

目的观察经腺病毒介导的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转染的成骨细胞的体外表达及体内示踪情况,探讨GFP作为组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法以腺病毒为载体,293A细胞为包装细胞,介导GFP转染成人骨髓源成骨细胞,与未转染的同期细胞作对照,在相差显微镜和荧光显微镜下观察,流式细胞术检测GFP表达效率;分别检测转染后两组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性与骨钙素(OCN)的含量;并将GFP转染8d后的成骨细胞植入裸鼠股部肌袋内,术后4、8周取材进行荧光显微镜、HE染色组织学和免疫组织化学染色观察。结果GFP转染的骨髓源成骨细胞表达绿色荧光的阳性率达75%以上,转染8d后的成骨细胞表面抗原标志CD29、CD44高效表达,而CD34不表达;转染后4、8d细胞内ALP活性与OCN含量与未转染组比较差异无显著性意义(P>005)。GFP转染8d后的成骨细胞植入裸鼠体内4、8周均可表达明显的绿色荧光,并具有成骨细胞的形态特征,ALP免疫组化染色呈黄褐色。结论GFP能在体外转染、裸鼠体内示踪成骨细胞,是一种可用于组织工程研究的理想的活细胞示踪剂。     

重组腺相关病毒载体表达抗表皮生长因子受体抗体对胰腺癌细胞株抑制作用的研究

目的 构建能在体内长期表达抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体,观察其对人胰腺癌细胞株的抑制作用.方法 将抗人EGFR单链抗体可变区(SCFV)基因插入腺相关病毒载体的Kpn Ⅰ和BglⅡ位点,构建成含抗EGFR单链抗体基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-anfiEGFR).设立对照组(rAAV1-EGFP组)和实验组(rAAV1-anti EGFR组),观察抗EGFR单链抗体蛋白的表达情况.采用Western blot检测抗体蛋白的表达、CCK-8法和流式细胞仪检测6种人胰腺癌细胞株(PCT-3、SW1990、Capan-1、ASPC-1、MiaPaCa-2及PANC-1细胞)的抑制率和凋亡率.两组比较采用t检验.结果 抗EGFR单链抗体蛋白能在6种人胰腺癌细胞株中表达,对照组和实验组胰腺癌ASPC-1细胞抑制率分别为1.1%±2.4%和15.1%±3.5%,两组比较,差异有统计学意义(t=6.598,P＜0.05).对照组和实验组PANC-1细胞凋亡率分别为7.0%±3.0%和11.4%±2.5%,两组比较,差异无统计学意义(t=1.952,P＞0.05);对照组和实验组SW1990、ASPC-1、Capan-1、PCT-3、MiaPaCa-2细胞凋亡率分别为1.1%±0.8%、1.5%±0.7%、1.7%±1.2%、1.1%±0.7%、2.2%±1.1%和17.6%±2.2%、46.9%±3.9%、20.0%±2.8%、12.1%±1.6%、31.1%±2.5%,两组比较,差异均有统计学意义(t=12.208,19.846,10.405,10.909,18.327,P＜0.05).结论 成功构建了携带抗EGFR单链抗体基因的rAAV载体,其表达的抗EGFR单链抗体蛋白对人胰腺癌细胞株有明显的抑制作用.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

腺相关病毒介导的PD—L1基因转染对大鼠肝移植术后肝脏的保护作用

目的：探讨腺相关病毒（AAV）介导的PD—L1基因转染对大鼠移植肝的保护作用及其可能机制。方法：96只近交系大鼠随机分为等基因肝移植组（G1）、同种异体肝移植组（G2）、AAV空载体组（G3）和PD—L1转染组（G4）,每组12对。通过大鼠肝移植急性排斥模型,将PD—L1-AAV2-RFP（RFP）经门静脉灌注夹闭法转染供肝,观察移植后大鼠中位生存时间（MST）,全自动生化分析仪测定肝功能,在荧光显微镜、光镜同视野下观察RFP在移植肝的表达和病理变化。采用免疫组织化学染色法评估PD—L1蛋白的表达及炎性细胞浸润情况。结果：G1在观察期内全部存活;G2与G3MST分别为18（17-20）d和18（17-19）d;G4显著延长了移植肝的存活（MST29d,P〈0．05）。术后14dG4的肝功能及病理变化与术后7dG2和G3相似。G3、G4术后7d中观察到明显的红色荧光,随时间逐渐增强。移植肝PD—L1蛋白的变化趋势与RFP的表达相似。G1移植肝T细胞含量极少;术后14dG2、G3移植肝CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋不同程度淋巴细胞浸润,G4移植肝T淋巴细胞浸润明显减少,尤以CD8^＋细胞为著,与各组相比差异显著（P〈0．05）。结论：腺相关病毒介导的PD—L1基因转染可延长移植肝的存活,其机制可能是PD—L1基因转染增强了PD—L1／PD-1信号通路,通过抑制移植肝CD4^＋、CD8^＋、CD25^＋T细胞浸润及其功能,从而发挥对移植肝的保护作用。     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

9型重组腺相关病毒介导抗核转录因子-κB核酶基因体外转染大鼠心肌细胞及对核转录因子-κB活性的影响

目的 观察9型重组腺相关病毒(rAAV9)介导抗核转录因子-κB(NF-κB)核酶基因(rAAV9-ECFP-R65)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对NF-κB活性的影响.方法 rAAV9-EGFP-R65按转染复数(MOI)1×106v.g./cell转染H9C2细胞,在倒置荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)阳性表达,采用流式细胞仪检测转染效率.Alamar Blue法检测rAAV9-EGFP-R65对H9C2细胞增殖影响.肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、rAAV9-EGFP-R65及PDTC处理H9C2细胞,凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测NF-κB活性.结果 转染后第1天EGFP开始表达,表达强度随着时间延长而逐渐增强,第5天达到高峰,此时流式细胞仪检测转染率为(32.27±3.19)%.Alamar Blue法检测表明转染组细胞增殖末受影响.常态下H9C2细胞NF-κB有一定活性,TNF-α刺激后NF-κB活性明显增高,而rAAV9-EGFP-R65、PDTC抑制NF-κB活性.结论 rAAV9-ECFP-R65能够有效地转染H9C2细胞,对细胞增殖无明显抑制,并能显著抑制H9C2细胞NF-κB活性.     

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

腺相关病毒载体介导的TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖的影响

目的:探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus;AAV)载体介导的基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1;TIMP1)对人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法:单层培养并鉴定人退变腰椎间盘髓核细胞.采用绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)检测其对髓核细胞的转染效率.应用构建的rAAV2-TIMP1转染髓核细胞;通过细胞形态学观察、35S标记氨基酸整合法检测rAAV2-TIMP1对人退变腰椎问盘髓核细胞基质合成的影响.在35S检测中;以未转染的退变髓核细胞做为正常对照组.结果:光镜下观察所培养的细胞类型以成纤维样细胞为主;Ⅱ型胶原免疫组化和番红O染色鉴定培养细胞为髓核细胞.AAV转染人退变腰椎间盘髓核细胞的转染效率为12%.35S标记整合法检测rAAV2-TIMP1转染组每分钟计数值为341.43±42.85;正常对照组为224.20±29.26;两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TIMP1能够促进退变椎间盘髓核细胞蛋白多糖的合成.     

pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞对后肢缺血大鼠血管生成的影响

目的 探讨经肌肉注射转染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对后肢缺血大鼠血管生成的影响.方法 Wistar大鼠30只,制成双后肢缺血模型,双盲法随机分为基因治疗组(肌注经pEGFP-C1/Akt转染的MSCs)、非基因治疗组(肌注MSCs)及对照组(肌注PBS液).造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1～7 d内,每天用红外线皮温仪测定大鼠后肢皮温变化.28 d时经动脉造影观察后肢血管生成情况; 免疫组化染色检测后肢毛细血管密度; 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测后肢肌肉组织中Akt及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的 mRNA和蛋白的表达.结果 移植3 d后基因治疗组大鼠后肢皮温升高明显.28 d时经动脉造影观察基因治疗组后肢侧支血管生成明显; 荧光显微镜观察有绿色荧光细胞在基因治疗组的内收肌和半膜肌分布.毛细血管密度: 基因治疗组为(7.1±0.3)个/高倍镜,非基因治疗组为(4.2±0.4)个/高倍镜,对照组为(1.3±0.2)个/高倍镜,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表达分析: 基因治疗组Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白(1.12±0.13)及VEGF mRNA(1.11±0.11)和蛋白(0.97±0.13)表达水平均明显高于非基因治疗组Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白(0.78±0.12)及VEGF mRNA(0.78±0.14)和蛋白(0.67±0.11)以及对照组Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白(0.36±0.12)及VEGF mRNA(0.56±0.11)和蛋白(0.33±0.13)的表达水平(P＜0.01),后2组间比较差异亦均有统计学意义(P＜0.01).结论 pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓MSCs促进后肢缺血大鼠血管生成的效果优于单纯MSCs治疗,为基因转染MSCs治疗缺血性疾病提供可能.