TGF-β1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的TGF-β1基因转染条件、剂量及基因治疗的安全性,体外将TGF-β1基因转入骨膜源间充质干细胞(MSCs),用水貂肺上皮细胞生长抑制法、透射电镜及软琼脂培养等方法检测.结果发现转基因MSCs表达的TGF-β1具有生物学活性.当3μl脂质体介导1μgTGF-β1基因转染时,能获得最佳转染效率和促MSCs增殖及向成软骨方向定向分化效应;转基因细胞无恶性转化倾向.从而把组织工程学与分子生物学有机结合成为分子组织工程学,为高质量地修复关节软骨缺损奠定了良好的基础.     

TGF—β1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的TGF－β1基因转染条件，剂量及基因治疗的安全性，体外将TGF－β1基因转入骨膜源间充质干细胞（MSCs) , 用水貂肺上皮细胞生长抑制法，透射电镜及软琼脂培养等方法检测，结果发现：转基因ＭＳＣs表达基因TGF-β1具有生物学活性，当３μ１脂质体介导１μgＴＧＦ－β１基因转染时，能获得最佳转染结合成为分子组织工程学，为高质量地修复关节软骨损损奠定了良好的基础。     

转化生长因子β_1基因修饰的间充质干细胞/仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸(PLYS)的聚DL乳酸(PDLLA) 仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF-β_1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞--间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88%,其中孔径为150～200μm的有效孔占80%。所有细胞均能很好地粘附于基质材料上,其中TGF-β_1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用分子组织工程学原理可使TGF-β_1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞-基质材料之间存在的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

转化生长因子β1基因修饰的间充质干细胞／仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β1（TGF－β1)基因转染对间充质干细胞（MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸（PLYS）的聚DL乳酸（PDLIA）仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF－β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞－－间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88％,其中孔径为150－200μm的有效孔占80％。所有细胞增能很好地粘附于基质材料上,其中TGF－β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用扮子组织工程学原理可使TGF－β1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞－－基质材料之间非的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

转化生长因子β1基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

目的 观察转化生长因子β1（TGF－β1）基因能否转入骨髓基质干细胞（MSCs)，并探讨经TGF－β1基因转染后的MSCs增殖和分化情况。方法 取新西兰雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源MSCs体外培养。将重组TGF－β1和空载pcD-NA3基因分别转染MSCs后，免疫组化（SABC）法检测TGF－β1转染是否成功，用透射电镜和流式细胞仪观察两组MSCs的增殖和分化情况。结果 SABC法证明TGF－β1瞬间转染成功；转染48h后，实验组MSCs增殖较对照组显著；实验组MSCs具有一定的分化趋势。结论 重组TGF－β1基因转入骨髓源MSCs的方法是可行的，瞬间TGF－β1转染对MSCs的增殖和分化有显著促进作用。     

负载转化生长因子β1的大鼠脂肪干细胞成软骨细胞分化

目的转化生长因子β1基因转染大鼠的脂肪基质干细胞（AOSCs），诱导其向软骨细胞分化，为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs；采用免疫荧光法进行鉴定；TGF-β1基因转染ADSCs，对转染后细胞进行筛选；MTT法测定筛选后细胞的增殖活性；KT-PCK、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs；细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，CD106和CD34表达阴性；基因转染后细胞的增殖力变强；转染转化生长因子β1的ADSCs在目的基因的表达和软骨特异性基质的分泌上明显高于转染空载体组和对照组；结论转化生长因子β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征，可以用作组织工程学的种子细胞。     

阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的探讨阿仑膦酸钠(ALN)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化能力的影响,观察其促BMSCs骨向分化过程中对转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果 ALN最佳促BMSCs增殖和骨向分化浓度为1×10-8mol/L,该浓度ALN能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;具有促BMSCs骨向分化能力的ALN各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论 ALN能促进BMSCs增殖和骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一。     

kartogenin对骨关节炎的治疗作用机制及其在软骨组织工程学中应用的研究进展

kartogenin （KGN） 是近年来发现的小分子物质,其可通过调节核心结合因子β亚基（CBFβ）-Runt相关转录因子1（RUNX1）等信号通路促进间充质干细胞（MSCs）增殖和成软骨分化修复软骨缺损,并可与转化生长因子β3（TGF-β3）产生协同作用。KGN的成软骨分化作用还与其旁分泌机制有关。除促软骨再生修复外,KGN还可通过保护软骨和软骨细胞,促进人润滑素分泌,保护和改建软骨下骨及缓解疼痛,从而对骨关节炎（OA）产生治疗作用。此外,利用KGN的结构和功能特点,大量软骨组织工程学研究将其以物理或化学方法结合于各类载体以修复软骨缺损和治疗OA。现结合相关文献阐述KGN对OA的治疗作用机制,并从纳米级和微米级聚合物、水凝胶及其他聚合物支架三3方面就软骨组织工程学研究中用以搭载KGN的载体组成、理化特点、释药特点及优势性能等进行综述,旨在为OA的软骨组织工程学治疗提供新思路和新靶点。     

Smad3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）信号转导通路下游信号分子Smad2、Smad3在TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨分化中的作用。方法采用RT-PCR、Western blot检测TGF-β1促MSCs成骨分化过程中Smad2、Smad3mRNA和蛋白表达的变化;脂质体介导稳定转染Smad3ΔC,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶（ALP）和核心结合因子（cbfa1）mRNA的表达,用对硝基苯磷酸盐（PNP）法检测细胞ALP活性,用茜素红染色法检测细胞矿化能力,观察Smad3ΔC对MSCs成骨分化的影响。结果在TGF-β1刺激后24h,MSCs中Smad3的mRNA和蛋白表达量明显减少（P〈0.01）,而整个刺激过程中,Smad2的mRNA和蛋白表达量无明显变化（P〉0.05）;稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSCs和V-MSCs（空载体转染组）中ALP、cbfa1mRNA的表达水平、矿化能力明显高于Smad3ΔC-MSCs;随TGF-β1刺激时间延长,Smad3ΔC-MSCs中ALP活性增加缓慢,仅于48h有明显增加（P〈0.05）,但与同时段MSCs和V-MSCs中ALP活性相比,差异有极显著性意义（P〈0.01）。结论TGF-β1促进MSCs成骨分化这一生物学效应的输出受Smad3特异性和选择性的调节。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响

目的 构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用.方法 构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化.结果 沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度.结论 pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用.     

骨髓间充质干细胞构建组织工程半月板软骨种子细胞

目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞（Mesenchynml stem cells,MSCs）,在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-βl,TGF-β1）协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

转化生长因子β1基因转染对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用.方法:以腺病毒为载体将人TGF-β1基因导入体外培养的人结肠癌细胞株SW480, 应用免疫组织化学及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SW480细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白及mRNA的表达情况.通过MTT法检测转染后细胞增殖的抑制情况.结果:转染hTGF-β1基因后,与对照组相比,TGF-β1蛋白和mRNA在细胞中的表达均增强.SW480的增殖受到明显抑制(P<0.05),抑制率为60%～80%.结论:转染hTGF-β1基因对体外培养的结肠癌细胞SW480的增殖有明显抑制作用.     

IGF-Ⅰ联合TGF-β1促成骨细胞的增殖和分化效应

目的 探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(rhlGF-Ⅰ)和重组人转化生长因子β 1(rhTGF-β1)联合应用对成骨细胞增殖和分化的影响.方法 ①体外培养成骨细胞株MG-63,分组以不同浓度的IGF-β(0.1、1.0、10.0和100.0 ng/mL)或TGF-β 1(0.01、0.1、1.0和10.0 ng/mL)培养,MTT法检测细胞增殖,得到IGF-Ⅰ与TGF-β单独作用的最适浓度.②选用最适浓度的IGF-Ⅰ,TGF-Ⅰ单独或联合培养,MTT法检测细胞增殖,ALP试剂盒检测细胞分化,分析两种细胞因子联合应用时,在成骨细胞增殖和分化过程中的作用.结果 ①IGF-Ⅰ与TGF-β对成骨细胞MG-63均有一定的促增殖和促分化作用.促增殖作用以10 ng/mL的IGF-Ⅰ在第3天,1 ng/mL的TGF-β1在第5天最为显著.②在上述浓度联合刺激条件下,促增殖和促分化效果均优于单一的IGF-Ⅰ或TGF-β1单独应用组.结论 IGF-Ⅰ与TGF-β1均有一定的促MG-63细胞增殖和分化效应,两者联合应用时具有良好的协同作用.     

骨髓间充质干细胞与脱细胞基质构建组织工程材料的研究进展

1．1BMSCs概念及其特点间充质干细胞（MSCs）是一类来源于中胚层的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞,广泛分布于骨髓、脐血、外周血、胎盘、胎肝、胎肾、胎肺、软骨膜、骨膜、脂肪及肌肉等组织中。BMSCs具有长的突触,最易获取,因此是目前用于MSCs研究的主要来源。MSCs在特定的条件下可以诱导分化为跨系,甚至跨胚层的组织细胞,成为现代组织工程学中理想的种子细胞;同时,MSCs易于导入外源目的基因,易于外源基因的转染和表达,因此也成为基因治疗的首选细胞。     

Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,抑制Notch-1基因的表达,从而观察Notch-1基因在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞后的存活及分化中的作用.方法:构建mNotch-l短发夹状RNA(short hairpin RNA,mNotch-1shRNA);然后对mNotch-lshRNA转染的MSCs进行形态学观察;MTT检测转染前、转染24h、转染3天的MSCs的存活率;体外条件下采用BDNF、全反式维甲酸等诱导mNotch-lshRNA转染的MSCs分化,采用免疫细胞化学染色,检测Nestin、NSE及NF200(神经元标记物)、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达.结果:mNotch-lshRNA转染成功的细胞立体感增强,Notch-1基因表达消失,转染后24h和3天的MSCs细胞存活率下降,与未转染和转染对照组比较有显著性差异(P＜0.01);转染mNotch-1shRNA的MSCs向神经细胞的分化效率显著提高,NSE、NF200的表达均高于未转染的和转染对照组的,且未见GFAP表达.结论:mNotch-lshRNA抑制Notch-1基因的表达,促进MSCs向神经细胞的分化效率,提示MSCs的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会加MSCs向神经细胞分化的效果.     

TGF-β1 对骨髓间充质干细胞在无氧无血清条件下凋亡的影响

目的:探讨TGF-β1 对骨髓间充质干细胞(MSCs)在无氧无血清条件下凋亡的影响.方法:取大鼠骨髓,体外分离,扩增培养MSCs;TGF-β1腺病毒或对照GFP腺病毒转染MSCs.细胞分为TGF-β1-MSCs组、GFP-MSCs组,MSCs组.RT-PCR检测TGF-β1基因的表达;无氧无血清条件下分别诱导各组细胞 4,8,12 h, 流式细胞仪检测凋亡变化;RT-PCR检测 bcl-2 mRNA的表达.结果:TGF-β1转染的MSCs表达TGF-β1基因水平与GFP-MSCs组,MSCs组相比均增加(P＜0.05);细胞在无氧无血清条件下诱导4,8,12 h,后TGF-β1-MSCs组的凋亡率与GFP-MSCs组,MSCs组的凋亡率相比降低(P＜0.05),且随时间的推移呈升高的趋势(P＜0.05);bcl-2 mRNA在无氧无血清条件下诱导4 ,8,12 h后的表达水平TGF-β1-MSCs与GFP-MSCs、MSCs相比均增加(P＜0.05),且随时间的推移均呈降低趋势(P＜0.05).结论:TGF-β1修饰的MSCs可稳定高效表达TGF-β1基因;TGF-β1-MSCs通过上调bcl-2 mRNA水平抑制无氧无血清诱导的凋亡.