靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165）的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165 重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting 法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果：成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论：成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

Construction of recombinant adeno-associated virus vector co-expressing hVEGF_(165) and hBMP_7 gene

Objective: To construct recombinant adeno-associated virus co-expressing human vascular epithelial growth factor 165(hVEGF165) and bone morphogenetic protein 7(hBMP7),measure the virus titer and verify the recombination. Methods:The AAV helper-free system was used as basis to generate recombinant AAV. The IRES sequence of plasmid pIRES was cut down and subcloned into ITR/MCS containing vector pAAV-MCS to construct recombinant plasmid pAAV-MCSa-IRES-MCSb. The hVEGF165 and hBMP7 gene was amplified by PCR and inserted into upstream MCSa and downstream MCSb respectively. Then,recombinant plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7,pAAV-RC and pHelper were co-transfected into AAV-293 cells to complete rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 packaging. The GFP labeled rAAV-IRES-GFP was simultaneously packaged by using the parallel plasmid pAAV-IRES-hrGFP. The efficiency of AAV packaging was monitored under fluorescent microscope and recombinant viral particles were harvested from infected AAV-293 cells. The virus titer was measured by infecting AAV-HT1080 cells,and the recombinant AAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by PCR of the exogenous interest genes. Results:Recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was verified by double digestion. GFP expression in AAV-293 could be observed under fluorescent microscope 72 h after transfection and the system provided a high packing ratio of 95%. The recombinant adeno-associated virus has a high titer of 5.5×1011vp/ml,and AAV-HT 1080 was infected at a ratio of 90%. The recombinant virus was confirmed by PCR of exogenous hBMP7 and hVEGF165 gene. Conclusion:Recombinant rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP7 was successfully constructed with a high virus titer,which may offer foundation for in vitro and in vivo experiments of hVEGF165 and hBMP7 co-expression and provide a new method for gene therapy of bone regeneration.     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

反义VEGF165腺病毒重组体的构建及鉴定

目的 :构建含人反义血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因的重组腺病毒载体 ,为采用反义VEGF16 5RNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人VEGF16 5cDNA反向插入到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,即pAd -ahVEGF16 5。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人反义VEGF16 5基因的重组腺病毒Ad -ahVEGF16 5。通过PCR共扩增法鉴别Ad -ahVEGF16 5的正确与否。根据 2 6 0nm的紫外光吸收值计算病毒滴度。结果 :VEGF16 5cDNA成功地反向插入了pHCMVSP1A载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了5 76bp的反义VEGF16 5基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad -ahVEGF16 5的正确性。病毒滴度为5 .6× 10 11pfu/ml。结论 :成功构建了携带人反义VEGF16 5基因的腺病毒Ad -ahVEGF16 5 ,本研究为采用反义VEGFRNA途径治疗肿瘤的在体、离体实验奠定了基础     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

脑梗死大鼠经血管内皮生长因子165基因治疗后热休克蛋白70的表达

目的观察脑梗死大鼠经血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗后热休克蛋白70(HSP70)的表达。方法将25只大鼠随机均分为以下5组:正常对照组(A组);假大脑中动脉闭塞(MCAO)组(B组);MCAO组;空载质粒对照组(D组);hVEGF165基因治疗组(E组)。建模7 d后采用免疫组化的方法观察各组动物脑组织中的HSP70 的表达。结果(1)在皮质中,A、B两组HSP70均低表达(P>0.05);C、D两组表达均较高(P>0.05),与A、B两组相比有较显著的差异(P<0.01);E组表达最强,与各组相比均有显著差异(P<0.01)。(2)在半暗带中,C、D、E各组HSP70 表达均较高,C、D两组间无显著差异(P>0.05),而E组显著高于C、D组(P<0.01)。(3)在梗死灶内,E 组表达较高,显著高于C、D组(P< 0.01)。结论经hVEGF165基因治疗的脑梗死大鼠HSP70表达显著增高,提示VEGF165基因可诱导HSP70的表达。     

重组逆转录病毒hVEGF165基因转染对人骨髓基质细胞成骨影响

目的:观察重组逆转录病毒人血管内皮生长因子165(retrovirus pLXSN/hVEGF165)基因转染对人骨髓基质细胞(hM-SCs)成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养人hMSCs,体外扩增纯化后随机分为4组:①retrovirus pLXSN/hVEGF165组:培养液中加入人血管内皮生长因子基因重组逆转录病毒1×1010OPU/ml,孵育24h后换普通培养液继续培养;②retrovirus pLXSN组:培养液中加入逆转录病毒空载体,其余处理与retrovirus pLXSN/hVEGF165组相同;③阳性对照组:培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠;④空白对照组:不给予特殊处理。各组细胞处理后2周,免疫组化观察VEGF表达,Von Kossa染色检测人hMSCs中骨胶原结节形成,全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性。结果:经多次换液传代,人hMSCs呈均一梭形形态。处理后retrovirus pLXSN/hVEGF165组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少。retroviruspLXSN组和空白对照组形态无明显变化。免疫组化染色见VEGF主要在胞浆内表达,...