InnVit基因对永生化黑素细胞B10BR迁移的影响

目的分析InnVit基因对永生化黑素细胞B10BR迁移的影响,探讨InnVit基因对黑素细胞生物学功能的调控情况。方法化学合成InnVit基因特异性SiRNA,构建InnVit基因表达载体P3XF-P120,lipofectamineTM2000转染B10BR细胞。半定量RT-PCR鉴定抑制和过表达效率;Transwell观察InnVit基因抑制和过表达后黑素细胞的迁移能力,明胶酶谱分析MMP2和MMP9的活性。结果成功在永生化黑素细胞B10BR中抑制和过表达InnVit基因。细胞处理20h后,抑制和过表达组Transwell滤膜下层黏附细胞数与对照组相比无显著性差异(P0.05),MMP2和MMP9活性较对照组也无显著性差异(P0.05)。结论InnVit基因对黑素细胞的迁移无明显调控作用。     

InnVit基因对B10BR细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 分析InnVit基因的抑制和过表达对永生化黑素细胞株B10BR细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨InnVit基因的生物学功能及其对白癜风中黑素细胞缺失的影响。方法 化学合成InnVit基因特异性siRNA片段以及构建过表达质粒载体P3XF-P120,lipofectamineTM 2000脂质体方法转染B10BR细胞。半定量RT-PCR法检测InnVit基因mRNA水平;Western印迹检测该蛋白水平变化;MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞技术分析细胞周期和凋亡的变化。结果 InnVit基因抑制后mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,InnVit基因过表达质粒组mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;转染后24、48、72 h抑制组的细胞存活量极显著下降（P < 0.01）,过表达质粒组的细胞存活量在48和72 h极显著增加（P < 0.01）。转染后48 h基因抑制组的早期凋亡率从（10.24 ± 1.00）%升至（37.34 ± 3.26）%,过表达质粒组早期凋亡率从（14.58 ± 1.49）%降至（8.43 ± 0.86）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）;转染48 h基因抑制组的G1期细胞由（56.11 ± 5.46）%增至（69.76 ± 6.08）%（P < 0.05）,过表达质粒组的G1期细胞由（55.14 ± 5.65 ）%降至（29.33 ± 3.01）%（P < 0.01）。结论 InnVit基因抑制使细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡;InnVit基因的过表达增强了细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡。其增殖能力的改变可能是通过细胞周期的调控调节的。     

皮肤科学基础

InnVit基因沉默对黑素细胞B10BR黑素合成和细胞凋亡的影响；黑素瘤细胞生长因子表达及微血管密度研究；中药对黑素细胞生物学活性影响的研究进展；不同中波紫外线照射对角质形成细胞干细胞因子／kit表达及黑素细胞迁移的影响；APP17肽对长波紫外线辐射人皮肤成纤维细胞氧化损伤的保护机制；     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

槲皮素对鼠黑素细胞株B10BR细胞的抗氧化保护效应及对其生物学活性的影响

目的 探讨槲皮素保护鼠永生化黑素细胞（B10BR）对抗氧化应激的有效性及其对B10BR细胞生物学活性影响。方法 MTT法测定B10BR细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,倒置显微镜下观察细胞形态改变,并检测槲皮素对酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。结果 经33.33 μmol/L槲皮素预处理24 h后细胞活性增高至（94.22 ± 3.36）%,此外黑素细胞的酪氨酸酶活性及黑素含量可分别增高至（107.15 ± 10.96）%和（111.85 ± 9.49）%,与过氧化氢处理组相比,差异均有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测结果表明,槲皮素可抑制过氧化氢诱导的黑素细胞凋亡。结论 槲皮素抑制过氧化氢诱导黑素细胞凋亡的保护效应为其治疗白癜风提供一定的依据。     

靶向生存素的小干扰RNA抑制人黑素瘤M14细胞系生长的研究

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对人黑素瘤M14细胞系生存素基因表达的抑制作用及对细胞凋亡、增殖和侵袭的影响。方法 构建靶向生存素的siRNA表达质粒,用脂质体法转染M14人黑素瘤细胞。RT-PCR检测M14细胞生存素mRNA的表达,Western印迹检测生存素蛋白的表达,流式细胞仪检测AnexinV标记的凋亡细胞,噻唑蓝（MTT）法分析细胞增殖,Transwell法分析侵袭能力。结果 与M14细胞和转染空载体的M14细胞比较,转染siRNA的表达质粒可以明显抑制生存素基因在转录和翻译上的表达。M14组和空载体组几乎无凋亡细胞,siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加（χ2 ＝ 31.55,P < 0.01）。细胞增殖抑制率（63.6% ± 1.6%）也明显增加,同时Transwell细胞侵袭实验显示,siRNA表达质粒转染组抑制作用显著。结论 靶向生存素的siRNA表达质粒可以特异性抑制生存素的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖和侵袭并诱导细胞凋亡。     

微小RNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响

目的 研究微小RNA（microRNA）-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 采用实时荧光定量PCR法（TaqMan探针法）检测microRNA-let-7a在A375细胞及黑素细胞的表达差异;然后用microRNA-let-7a的模拟物转染A375细胞,流式细胞仪检测其凋亡的改变;最后采用Western印迹检测转染后半胱天冬酶-3（caspase-3）蛋白的变化。结果 与黑素细胞相比,microRNA-let-7a在A375细胞中表达下降了0.462倍;采用microRNA-let-7a的模拟物转染后,与阴性对照（细胞凋亡率16.9%）相比,A375细胞凋亡（细胞凋亡率47.4%）增加;转染后caspase-3蛋白表达下调。结论 microRNA-let-7a可促进黑素瘤细胞系A375的凋亡,同时下调caspase-3蛋白的表达。     

RNA干扰下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭和失巢凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭的影响和可能机制。 方法 用PLK1小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染人恶性黑素瘤A375细胞后,分别用实时定量PCR和 Western 印迹法检测PLK1mRNA和蛋白表达,Transwell方法检测细胞侵袭能力,以平板集落形成方法了解癌细胞集落形成情况,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测癌细胞失巢凋亡情况。 结果 恶性黑素瘤A375细胞经PLK1 siRNA转染后,PLK1 mRNA和蛋白表达明显下调;siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制。与空白对照组和脂质体对照组比较,siRNA细胞转染组侵袭性明显下降。失巢凋亡检测发现,琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯度图谱。TUNEL结果显示,PLK1 siRNA可诱导恶性黑素瘤A375细胞凋亡,siRNA细胞转染组较空白对照组和脂质体对照组凋亡指数明显升高［3.86% ± 0.35%（3.125 nmol/L siRNA组）,7.35% ± 0.36%（6.250 nmol/L siRNA组）,17.56% ± 0.38%（12.500 nmol/L siRNA组）比1.15% ± 0.25%和1.18% ± 0.22%）,均P < 0.01］。 结论 PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

治疗剂量窄谱中波紫外线对B1OBR黑素细胞增殖、凋亡及黑皮素受体-1表达的影响

目的 通过观察311 nm窄谱中波紫外线(NB-UVB)对黑素细胞增殖、凋亡及黑素合成的影响,探讨NB-UVB在白癜风复色中的可能机制.方法 永生化B10BR黑素细胞,采用400、800、1200 mJ/cm2的311 nm NB-UVB照射,MTT法及流式细胞仪测定细胞增殖及凋亡变化,NaOH法测定黑素含量变化,RT-PCR方法测定B细胞淋巴瘤-2(BCL-2)表达变化,免疫细胞化学方法及Western印迹测定黑皮素受体-1(MC-1R)表达.结果 用不同剂量NB-UVB照射B10BR后,黑素细胞的增殖和凋亡没有显著变化.但随着NB-UVB照射剂量增加,黑素合成呈剂量依赖性增加,分别为正常对照组的1.42倍、1.78倍、2.05倍.BCL-2的表达显著增加,分别为正常对照组的1.75倍、2.32倍、3.28倍.黑素细胞MC-1R蛋白表达也显著增加,分别为对照组的1.68倍、2.35倍、3.01倍.结论 治疗剂量的311 nm NB-UVB不会导致黑素细胞凋亡,并且可以通过上调BCL-2及MC-1R的表达,增强黑素细胞的抗氧化应激能力,促进黑素合成.     

p21小干扰RNA对低浓度过氧化氢诱导的黑素细胞提前衰老和黑素传递的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制p21表达对低浓度过氧化氢(H₂O₂)诱导的黑素细胞提前衰老的影响,以及黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系。方法:p21 siRNA序列转染黑素细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及western blot检测抑制效率。将正常人黑素细胞分为对照组(阴性siRNA转染处理)、p21 siRNA组(p21 siRNA转染处理)、阴性siRNA+H₂O₂组(阴性siRNA转染24 h后加入400μmol/L H₂O₂处理)及p21 siRNA+H₂O₂组(p21 siRNA转染24 h后加入400μmol/L H₂O₂处理)。采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;EdU细胞增殖检测细胞增殖能力;western blot检测各组p21和树突调节蛋白[RhoA、Rac1及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)]表...     

女贞子对黑素细胞的黑素合成、细胞增殖和c-kit基因表达的影响

目的研究女贞子对体外培养的黑素细胞的影响.方法采用免疫印迹法检测酪氨酸酶蛋白(TRP)和酪氨酸激酶受体蛋白(KIT)含量;405 nm比色测定黑素细胞黑素含量;采用细胞数统计和显微镜观察的方法测定细胞毒性和对细胞增殖的影响.结果研究表明女贞子对黑素细胞的增殖和黑素合成有促进作用;对KIT蛋白合成有显著的促进作用.结论女贞子对黑素细胞增殖和黑素合成具有促进作用,该药物治疗白癜风的疗效可能与酪氨酸激酶受体蛋白含量提高相关.     

白细胞介素4对体外培养人黑素细胞增殖及黑素合成的影响

目的建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系,观察不同浓度白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)对体外培养正常人黑素细胞的细胞增殖及黑素合成的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐比色(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)法测定不同浓度IL-4对黑素细胞增殖的影响,氢氧压钠(NaOH)裂解法测定黑素生成量,流式细胞仪检测黑素细胞的凋亡率。结果 IL-4对黑素细胞活力有抑制作用,能使细胞增殖能力降低,黑素合成减少,增加黑素细胞的凋亡率。结论 IL-4对体外培养的黑素细胞增殖及黑素生成都有抑制作用,这为临床应用IL-4治疗色素性疾病提供了实验依据。     

山柰素与熊果苷对体外培养人正常黑素细胞的作用

目的比较山柰素与熊果苷对体外培养人正常黑素细胞增殖、黑素合成及其酪氨酸酶活性的影响,为探索色素沉着性皮肤病的发病机制以及筛选新的治疗药物提供理论依据。方法以不同浓度(1～100μmol/L)山柰素与熊果苷干预体外培养的人正常黑素细胞,比较两者对黑素细胞的黑素含量、细胞增殖及其酪氨酸酶活性的影响。结果对于黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的抑制作用,山柰素在各个浓度均优于熊果苷,差异有统计学意义(P<0.05),山柰素对细胞增殖抑制率无明显影响,而熊果苷在各浓度对细胞增殖抑制作用显著,且随其浓度增加,抑制率逐渐增强。结论山柰素对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的抑制作用强于熊果苷,并对黑素细胞的增殖及形态无明显的负面影响,是一种有良好应用前景的酪氨酸酶抑制剂。     

CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞对共培养人黑素细胞的影响研究

【摘要】 目的 探究敲减角质形成细胞KRT5基因对共培养黑素细胞黑素含量的影响,以解释屈侧网状色素沉着症（DDD）的色素增加性皮损形成的机制。方法 通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术获得KRT5基因杂合突变的HaCaT细胞,将转染非靶向单向导RNA：Cas9蛋白复合物的HaCaT细胞设为对照组,分别与人原代黑素细胞HEMn体外共培养。免疫荧光观察共培养细胞中细胞角蛋白及黑素小体表达;差异胰酶消化获得不同共培养组中黑素细胞,检测细胞内黑素含量。免疫组化检测1例KRT5突变DDD患者皮损和正常对照皮肤中黑素细胞特异性前黑素小体蛋白17（Pmel17）的表达改变。结果 Sanger测序显示,实验组HaCaT细胞KRT5基因第1外显子起始密码子发生杂合突变（c.1delA）,对照组HaCaT细胞KRT5基因未发生突变。Western印迹显示,实验组HaCaT细胞KRT5蛋白表达水平（0.60 ± 0.05）显著低于对照组（1.00 ± 0.00,t = 32.38,P = 0.001）。HEMn细胞与实验组HaCaT细胞共培养体系中Pmel17标记的黑素小体较与对照组共培养体系增多,且细胞内黑素含量增加52.5%,差异具有统计学意义（t = -3.48,P = 0.025）。KRT5突变DDD患者皮损组织中Pmel17表达量较正常对照皮肤增加。结论 本研究通过CRISPR-Cas9诱导KRT5基因突变的HaCaT细胞,与黑素细胞在体外建立共培养细胞模型,验证了其对共培养黑素细胞的影响,为进一步研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制以及皮肤色素异常的发病机制提供了初级研究模型。     

Differential effects on melanocyte growth and melanization of low vs. high calcium keratinocyte-conditioned medium

Epidermal keratinocytes secrete several growth factors that stimulate melanocyte proliferation and melanin pigment synthesis in vitro. As the epidermis is formed of two distinct layers, i.e. basal cell layer and suprabasal cell layers, and both are functionally and biologically different compartments, it was interesting to investigate which type of epidermal keratinocytes modulate melanocyte proliferation and function most. Normal human epidermal melanocytes (HMel) were incubated with melanocyte-conditioned medium (M-CM) and low Ca2+ and high Ca2+ keratinocyte-conditioned medium (K-CM) obtained from the same skin source of melanocytes. The morphology, proliferation rate and melanin synthesis were evaluated at days 3, 6 and 12 of incubation. The results showed no evidence of major morphological changes in the epidermal melanocytes with any of the conditioned media, although marked dendrite formation was observed in coculture of melanocytes and differentiated keratinocytes. On the other hand, low Ca2+ K-CM induced a mild but statistically significant stimulation of melanocyte growth in a time-dependent manner. The significant percentage increase was evident on day 6 (124.6%, P < 0.05) and on day 12 (138.1%, P < 0.01) of incubation. In contrast, high Ca2+ K-CM showed no significant effect on melanocyte proliferation (P > 0.05). Both low Ca2+ and high Ca2+ K-CM stimulated melanin synthesis, although synthesis induced by low Ca2+ K-CM was higher than that of high Ca2+ K-CM. The significant percentage increase induced by low Ca2+ K-CM was evident on day 6 (117.9%, P < 0.05) and on day 12 (127.8%, P < 0.05) of incubation, whereas it was evident with high Ca2+ K-CM only on day 12 (119.7%, P < 0.05) of incubation. It is concluded from the above data that keratinocytes grown at a low Ca2+ level release factors that stimulate melanocyte proliferation as well as melanin synthesis, whereas keratinocytes grown at a high Ca2+ level release factors that only stimulate melanin synthesis. This may provide an explanation of the anatomical position of melanocytes and may play a part in the pigmentary changes following injury to epidermal cells.