外周血内皮祖细胞种植小径聚氨酯人工血管及流体切应力处理的实验研究

本研究收集健康成人骨髓单个核细胞,用血管内皮生长因子等加以诱导分化,通过荧光显微镜和荧光免疫标记等方法观察和鉴定诱导后的细胞。之后将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面,予以15 dyn／cm2的流体切应力处理,并用扫描电镜观察。结果发现外周血单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,ac- LDL及lectin抗体荧光标记阳性。扫描电镜下,未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行;静态种植细胞后,人工血管表面内皮祖细胞排列不整齐;切应力条件下种植细胞后,人工血管表面内皮祖细胞排列较为整齐。因此,在体外能将外周血单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞,内皮祖细胞是小径人工血管内皮化的理想种子细胞。流体切应力对小径聚氨酯人工血管表面内皮祖细胞的生长排列有着良好的机械塑形作用。     

流体剪应力调节内皮化小径聚氨酯人工血管抗血栓特性的体外研究

研究不同流体剪应力条件下,内皮化小径聚氨酯人工血管分泌一氧化氮(Nitrogen monoxide, NO)和前列环素(Prostaglandin I2, PGI2)水平的变化,从而为剪应力处理调节内皮化小径聚氨酯人工血管抗血栓特性提供实验依据.分离健康成人外周血的单个核细胞并诱导分化成内皮祖细胞,通过相差显微镜和免疫荧光标记等方法对诱导分化后的细胞进行形态学观察和鉴定.种植内皮祖细胞到小径聚氨酯人工血管表面后,将内皮化小径聚氨酯人工血管分为静态组、低剪应力组(5 dynes/cm2)、中剪应力组(15 dynes/cm2)和高剪应力组(25 dynes/cm2)4个不同处理组,之后用硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法测定不同时间点培养液中NO和6-keto-PGF1α(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)的水平.外周血单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下呈典型的"纺锤样"梭形细胞, ac-LDL吞噬及lectin抗体荧光标记双阳性,FLK-1和vWF免疫荧光抗体染色均为阳性.流体剪应力增加种植人工血管表面内皮祖细胞NO和6-keto-PGF1α的产生,并且这种作用与剪应力大小呈正相关.因此,提高流体剪应力明显促进内皮祖细胞NO和PGI2等抗血栓物质的分泌,提示流体剪应力可改善内皮化小径聚氨酯人工血管抗血栓特性.     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。 目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。 方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。 结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景：内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。 目的：研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6 d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。  结果与结论：从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P < 0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化

背景：内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。 目的：观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。 方法：不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24 h以及30 mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20 g/L黄芪预处理24 h后,再加入30 mmol/L葡萄糖培养24 h。 结果与结论：高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力(P  < 0.05或0.01),给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强(P < 0.05或0.01)。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

内皮祖细胞与雌激素

背景：研究发现雌激素对血管内皮具有明显的保护作用,而内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞参与内皮的修复。 目的：总结内皮祖细胞生物特点及雌激素对内皮祖细胞作用的研究进展。 方法：应用计算机检索PubMed数据库及CNKI数据库,在标题和摘要中以“内皮祖细胞,雌激素”或“Endothelial progenitor cells,estrogen”为检索词进行检索。选择与内皮祖细胞生物学特点及雌激素对其作用研究相关的文献。 结果与结论：内皮祖细胞存在于骨髓和外周血中,是具有增殖、迁移、黏附能力并分化为血管内皮细胞潜能的原始细胞,可作为未来治疗心血管疾病的重要的靶点。雌激素对内皮祖细胞有保护效应,能增强内皮祖细胞增殖、迁移、黏附等生物活性,同时还能延迟内皮祖细胞衰老、拮抗其凋亡。但雌激素影响内皮祖细胞生物活性的具体靶点及机制尚有待进一步研究。     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。 目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。 方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1× 10⁶/cm²的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。 结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成与波动性高糖的影响

背景：研究表明波动性高血糖较持续性高血糖对血管内皮功能的损害可能更严重。 目的：观察波动性高糖对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及丙二醛、抗氧化因子合成的影响。 方法：密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞。取经培养鉴定后的内皮祖细胞,细胞同化后分别给予5.5 mmol/L,20 mmol/L,5.5/20 mmol/L葡萄糖(5.5,20 mmol/L的葡萄糖培养液每8 h更换1次)及20 mmol/L甘露醇。干预72 h后,MTT法检测内皮祖细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;比色法测定培养液中丙二醛水平及超氧化物歧化酶活力。 结果与结论：20 mmol/L和5.5/20 mmol/L葡萄糖作用72 h,内皮祖细胞增殖减少、凋亡率增高(P < 0.01）,培养液中丙二醛水平增高、超氧化物歧化酶活力降低(P < 0.01),均以5.5/20 mmol/L葡萄糖作用最明显(P  < 0.01)。说明波动性高糖较恒定性高糖更易抑制内皮祖细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与波动性高糖环境下氧化应激水平增高有关。     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。 目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。 方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CD133、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进一步鉴定培养细胞。 结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CD133、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac-LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

雌激素对孕妇外周血内皮祖细胞数量的影响

目的:研究妇女怀孕前、后外周血中内皮祖细胞数量的变化,初步探讨雌激素对内皮祖细胞的影响.方法:用微粒发光免疫分析测定法检测不同孕周孕妇血清中雌激素水平的变化;流式细胞仪检测未怀孕妇女及不同孕周孕妇外周血中内皮祖细胞的数量;通过跨膜迁移实验观察雌激素对循环内皮祖细胞的动员作用.结果:随着孕周的增加,雌激素水平增加;妇女怀孕后循环中内皮祖细胞数量增加,孕早期数量增加最明显;与对照组相比,雌激素组跨膜迁移细胞的百分率增大,且随着雌激素浓度的增大,差别有统计学意义.结论:妇女怀孕后循环中内皮祖细胞的数量增加明显,这种改变与体内雌激素水平有关.     

不同剪切力对内皮细胞表面凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1表达的影响

目的 研究不同剪切力对内皮细胞表面凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)表达的影响.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,将其种植于载玻片上,放入流室系统分别施加以不同的剪切力.按施加剪切力的不同分为实验组和对照组:实验组分为低剪切力组(4.2 dyne/cm2,n=5)、中等剪切力组(8.4 dyne/cm2,n=5)和高剪切力组(15.0 dyne/cm2,n=5);对照组(n=5)静态条件下培养,不施加剪切力.剪切力加载1、2、4、8 h后RT-PCR测定各组内皮细胞LOX-1 mRNA的表达.结果 低剪切力(4.2 dyne/cm2)作用下,内皮细胞LOX-1表达随时间延长而增加.与对照组比较,中等剪切力(8.4dyne/cm2)作用2、4、8 h内皮细胞LOX-1的表达水平均降低[2 h:0.2346±0.0397比0.2948±0.0128,4 h:0.1747±0.0585比0.2985±0.0204,8 h:0.0256±0.0067比0.2968±0.0175,均P＜0.05].高剪切力(15.0dyne/cm2)作用下,血管内皮细胞LOX-1表达一直维持在极低水平.结论 不同剪切力可以影响内皮细胞的LOX-1表达水平.     

内皮祖细胞与氧化应激研究进展

背景：内皮祖细胞是外周血中存在的一种干/祖细胞,是成熟内皮细胞的前体细胞,其与氧化应激的关系越来越受到人们的关注,而且国内外研究正日趋增多。 目的：对国内外内皮祖细胞与氧化应激关系的现状及新进展作一综述。 方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1997-01/2010-05关于内皮祖细胞与氧化应激的文章,在标题和摘要中以“内皮祖细胞,氧化应激”或“endothelial progenitor cells ,oxidative stress”为检索词进行检索。选择文章内容与内皮祖细胞与氧化应激有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到212篇文献,最终选择有代表性的34篇文献进行综述。 结果与结论：内皮祖细胞与氧化应激关系密切,虽然内皮祖细胞具有比成熟内皮细胞更强的抗氧化能力,但在长期氧化应激存在的情况下,氧化应激通过减弱其抗氧化酶的表达,增加氧化酶的表达而促进内皮祖细胞的凋亡而影响其功能及数量,故氧化应激是导致内皮祖细胞数量改变及功能受损的影响因素之一,而通过他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂/受体拮抗剂及过氧化物酶体激动剂的干预可改善内皮祖细胞的氧化应激状态,保护其功能。     

p53在层流剪切应力下对EPCs分化及功能的影响

目的:研究p53蛋白在层流剪切应力(LSS;12 dyn/cm2)作用下对内皮祖细胞(EPCs)分化及功能的影响,为心血管疾病的防治找到新的靶点.方法:采用密度梯度离心法获得大鼠骨髓单个核细胞,用EGM-2培养基诱导获得EPCs;通过Western blot方法检测p-p53及p53蛋白水平的变化;采用RT-qPCR及...     

细胞骨架F-actin在层流剪切应力诱导EPCs内皮分化中的作用

目的探讨细胞骨架F-actin在层流剪切应力促内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)向内皮分化中的作用。方法对大鼠骨髓来源的EPCs施以层流剪切应力(1.2 Pa),以荧光定量RT-PCR及流式细胞术检测特异性内皮细胞标记分子vWF、CD31 mRNA及蛋白的表达来反映EPCs分化程度;以免疫荧光染色观测F-actin的排列情况;应用Ras GTPase Pull-Down方法检测Ras活性。结果层流剪切力处理后,EPCs分化标记vWF及CD31的基因及蛋白表达较静止组明显升高(P<0.05),细胞骨架F-actin发生重排,Ras活性明显增高。细胞骨架稳定剂Jasplakinolide(JAS)及细胞骨架松弛剂Cytochalasin D(CytoD)预处理均不同程度地抑制了层流剪切应力所致的细胞骨架的重排、Ras活性的上调及EPCs分化效应(P<0.05),而过表达Ras则对层流剪切应力诱导的EPCs分化有明显促进作用(P<0.05)。结论一定大小的层流剪切应力可促进EPCs向内皮细胞分化,其机制可能与层流剪切应力重塑细胞骨架F-actin,进而影响Ras活性有关;这对于揭示受损血管内皮修复的具体机制、阐明动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机理及临床防治此类疾病具有一定的意义。     

血流剪切应力对内皮细胞表达人类凋亡蛋白抑制剂的作用

 目的：本研究目的是阐明血流剪切应力抑制血管内皮细胞凋亡的分子机制。方法: 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养于DMEM, 当细胞融合时，转染Smac基因，将细胞暴露于20 dyne/cm2 的剪切应力，分别测定人类凋亡蛋白抑制剂(human inhibitor of apoptosis protein-2, HIAP-2） 蛋白表达及细胞凋亡蛋白酶（caspase-3）活性。 结果: 20 dyne/cm2 的剪切应力抑制caspase-3活性的增加，此作用与剪切应力能够明显诱导内皮细胞产生HIAP-2 蛋白表达明显增加有关。 结论：证实生理水平剪切应力能够明显诱导内皮细胞产生HIAP-2 蛋白的表达，这可能是剪切应力抑制内皮细胞凋亡发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一。     

剪切力对血管内皮细胞表达IL-8的影响

本文利用改进的流室装置, 通过精密蠕动泵提供剪切力, 选择5dyne/cm2、10dyne/cm2、15dyne/cm2三种剪切力, 施加于体外培养的血管内皮细胞, 作用不同时间, 用RIA的方法检测流体动力学对血管内皮细胞表达IL-8的影响.结果表示, 不同剪切力作用内皮细胞后, IL-8的表达量与剪切力大小及作用时间有关, 为时间依赖性增长, 在5dyne/cm2组和10dyne/cm2组中, IL-8表达量明显高于空白对照组, 而15dyne/cm2组与对照组相比有下降趋势, 提示高剪切力有可能抑制IL-8的分泌.通过观察不同大小剪切力对血管内皮细胞表达IL-8的影响, 为探讨剪切力对动脉粥样硬化的影响提供一些数据.     

切应力和溶血磷脂酰胆碱对内皮细胞表面黏附分子表达的影响

在体内 ,内皮细胞的功能不仅受化学因子的调节 ,而且还受力学因素的影响。为探讨流体切应力和溶血磷脂酰胆碱 ( L ysophosphatidylcholine,L yso- PC)的双重作用对培养的人脐静脉内皮细胞 ( Hum an um bilical veinendothelial cells,HU VECs)表面黏附分子 ICAM- 1、VCAM- 1、E- selectin表达的影响 ,采用流式细胞仪技术检测了L yso- PC( 3 0 μg/m l)和流体切应力 ( 2 .2 3、4.2 0 dyne/cm2 )的协同作用下内皮细胞黏附分子表达的变化。结果显示 :在受剪切作用之前 ,用 L yso- PC孵育激活内皮细胞 ,或预先剪切后再用 L yso- PC孵育 ,内皮细胞的 ICAM- 1和VCAM- 1表达与两种刺激同时作用相比 ,显著增加 ( P<0 .0 5 ) ;切应力或 L yso- PC的单独作用 ,以及两种刺激同时存在对 HU VEC的 E- selectin表达无显著影响。而在受剪切作用之前 ,用 L yso- PC孵育激活内皮细胞 ,或预先剪切后再用 L yso- PC孵育 ,内皮细胞的 E- selectin表达与两种刺激同时作用相比 ,显著增加 ( P<0 .0 5 )。结论认为 :即使在不利于细胞黏附的力学环境中 ,流体切应力与 L yso- PC的协同作用 ,也可能是在炎症部位单核细胞对内皮细胞募集增加的重要原因之一