甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达及免疫反应性分析

目的构建甲型H1N1流感病毒HA基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白,并对表达蛋白的免疫反应性进行分析。方法人工合成A/California/05/2009 H1N1流感病毒的HA基因,以合成基因为模板,通过PCR方法扩增出去除信号肽的HA部分基因片段,然后将去除信号肽的HA基因克隆至pET30a(+)原核表达载体中,构建出原核表达质粒,再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达菌株;重组菌经IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot分析表达产物的免疫反应性。结果获得了HA基因的原核表达重组菌,细菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约67.4 ku大小的目的蛋白表达条带,Western blot结果显示,表达产物与人甲型H1N1流感患者阳性血清具有反应性。结论成功表达出甲型H1N1流感病毒的HA蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为甲型H1N1流感的快速诊断方法的建立提供了生物材料。     

SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定

目的 克隆SARS冠状病毒(SARs-CoV)S1基因片段，构建原核表达载体，并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白。方法人工合成SARS-CoV Sl基因片段，克隆至pUCm-T载体，经DNA序列分析和酶切后，将酶切片段亚克隆至原核表达载体pET-28b( )，重组子pET-28b／SARS-S1转化大肠杆菌ril，IPTG诱导表达，Western blot鉴定表达产物；纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性。结果 获得了主要以包涵体形式存在的32kD的目的蛋白，Western blot鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白，ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合。结论 成功构建了SARS-CoV S1基因的组氨酸标记表达载体pET-28b／SARS-S1，并在ril中得到了高效表达；表达的s1蛋白具有较好的抗原特异性，便于免疫动物以获得特异抗体，为SARS-CoV的实验室快速诊断打下了基础。     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

2009年上海地区甲型流行性感冒流行及甲型H1N1病毒分离株变异分析

目的 了解2009年上海地区人群流行性感冒(流感)的流行特征和流行期间甲型H1N1分离株基因和抗原的变异.方法 采集2009年上海地区哨点医院和学校聚集性流感样患者咽拭子标本,接种犬肾细胞(MDCK细胞)分离流感病毒,直接荧光免疫法鉴定流感病毒型,RT-PCR法鉴定亚型,对部分甲型H1N1流感病毒进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等片段全基因测序,分析甲型H1N1流感病毒HA、NA等基因变异.结果 2009年上海地区冬春季人群流感中,季节性H1N1和H3N2流感同时存在,进入第32周时,甲型H1N1和季节性H3N2流感同时流行,第40周后主要是甲型H1N1流行.甲型H1N1流行株HA进化分析显示,不同区域、不同月份分离株互有穿插,上海地区分离株聚集成簇形成一个分枝,与西班牙、俄罗斯、丹麦等国的流行株接近.HA演绎推导氨基酸位点虽有变异,但都不位于抗原决定区域;NA基因演绎推导氨基酸位点未观察到274位点及与耐奥司他韦药物相关其他位点的变异;PB2蛋白氨基酸序列分析显示,第627位和第701位氨基酸分别是谷氨酸和天冬氨酸,为禽源流感病毒PB2蛋白氨基酸位点.结论 2009年上海地区冬春季人群流感,季节性H1N1和H3N2同时流行,夏秋季开始甲型H1N1、季节性H3N2在人群中同时流行,之后以甲型H1N1为主.甲型H1N1与早期分离株比较有一定变异,但尚未出现流行病学意义的抗原漂移株,仍表现为对人的高亲和力和低致病性特征.     

甲型流感病毒株H1N1(09pdm)的分离及HA和NA基因分析北大核心CSCD

目的对成都某部人感染甲型流感病毒进行分离鉴定和基因突变分析。方法采集甲型流感患者咽拭子标本,通过MDCK细胞分离病毒毒株;采用免疫荧光法鉴定其感染细胞能力,采用基因分型特异性引物鉴定病毒亚型,PCR扩增血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)后测序,与NCBI数据库在线比对并利用MEGA软件构建系统发育进化树,分析突变位点。结果从甲型流感患者咽拭子标本中分离出1株流感病毒,经型特异性引物PCR鉴定为H1N1(09pdm)亚型,该毒株在37℃时对细胞致病力较强。免疫荧光检测到分离毒株感染细胞内甲型流感病毒核蛋白(NP)高表达,甲型流感病毒NP蛋白在细胞核和细胞质中均有大量分布。利用反转录PCR和测序获得该毒株HA和NA全长基因序列。在线比对及系统发育树分析显示,该毒株HA和NA序列与2017-2018流感季其他国家流行株同源性均>99%。对HA氨基酸突变位点进行分析,其序列的155位点存在组氨酸-酪氨酸(H-Y)点突变,该点突变也发生Influenza A/Hawaii/24/2018(H1N1)(MH245873)、Influenza A/North Carolina/19/2018(H1N1)(MH245873)和In-fluenza A/Missouri/51/2017(H1N1)(MH083792)毒株上。NA氨基酸序列与近期流行的毒株均相同。结论本起流感病毒株H1N1(09pdm)的HA、NA基因序列与同期其他国家流行株高度相似,但在HA氨基酸序列的155位点存在一个组氨酸-酪氨酸的点突变,其意义尚不清楚。     

上海地区2010年冬季甲型H1N1流行性感冒病毒株变异分析

目的 了解上海地区2010年冬季人群甲型H1N1流行性感冒(流感)病毒流行株基因及抗原的变异.方法 采集2010年12月至2011年1月间上海地区哨点医院流感样患者咽拭子标本137份,接种犬肾细胞(MDCK),分离流感病毒,直接免疫荧光法(DIF)鉴定流感病毒型,RT-PCR鉴定甲型H1N1,对部分甲型H1N1流感病毒株进行血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、病毒聚合酶(PB2)片段全基因测序,分析基因及氨基酸位点变异.结果 共分离到53株人流感病毒,48株为甲型H1N1流感病毒,按简单随机抽样法抽取19株测序.HA进化树分析发现,与2010年6月前分离的甲型H1N1毒株比较,绝大部分不位于同一主干上;HA蛋白的氨基酸位点分析显示,部分毒株在抗原决定位点上发生变异.NA蛋白酶活性中心及周围相关位点氨基酸组成保守,未检测到耐奥司他韦和扎那米韦的变异位点.PB2蛋白第627位和701位点分别是谷氨酸和天冬氨酸,仍是禽源流感病毒特征,但第677位点出现E677G突变.结论 2010年冬季上海地区人群甲型H1N1流感病毒流行株与之前春夏季分离株比较已经有一定变异,出现了一些抗原漂移和在哺乳动物宿主内的适应性进化.     

BVDV-1 VLPs的构建及免疫原性研究北大核心CSCD

目的利用C、E0、E1和E2蛋白构建BVDV病毒样颗粒,并评价BVDV-1 VLPs的免疫原性。方法以BVDV-BA株为模板通过反转录得到C、E0、E1和E2基因,再将C、E0、E1和E2基因分别克隆至PEASY-Blunt Simple克隆载体上。提取质粒摇菌扩大培养,将得到的C、E0、E1和E2基因克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10.Bac大肠埃希菌感受态细胞,通过蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-C、rB-E0、rB-E1和rB-E2。将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒;再用构建的4种重组杆状病毒同时感染SF9悬浮细胞,72 h后收集细胞沉淀进行超声破碎,利用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心进行纯化,通过Western blot和透射电镜进行鉴定。将获得的BVDV-1 VLPs联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体水平评价VLPs的免疫原性。结果成功克隆出C、E0、E1和E2基因,并构建C、E0、E1和E2蛋白的杆状病毒。通过纯化和鉴定,在20%~30%蔗糖层获得由C、E0、E1和E2蛋白组成结构完整的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。BVDV-1 VLPs能够显著增加免疫小鼠的特异性抗体表达水平。结论构建并获得了由C、E0、E1和E2蛋白组成,并具备良好免疫原性的病毒样颗粒BVDV-1 VLPs。     

汉坦病毒Hunan03株S基因克隆、表达及核蛋白免疫原性分析

目的构建汉坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中进行核蛋白表达,研究核蛋白的免疫性及免疫反应性。方法设计特异性扩增汉坦病毒Hunan03株S基因完整开放阅读框(ORF)的引物,RT-PCR扩增,产物克隆到pGM-T载体,转化感受态细胞TOP10,应用蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,转化Ecoli.BL21 Star^TM(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot对重组蛋白进行鉴定。应用Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,建立间接ELISA法对核蛋白的免疫原性与免疫反应性进行评价。结果PCR扩增S基因ORF区域产物大小约1 306 bp,重组载体pGEX-6p-2-S经双酶切、PCR、测序鉴定提示构建成功;在37 ℃,IPTG浓度为0.8 mmol/L诱导5 h的条件下,表达出最高量的相对分子量约74 kDa的GST-NP融合蛋白。建立的间接ELISA法检测GST-NP融合蛋白免疫后的新西兰兔血清,IgM抗体滴度达1∶8 000,IgG抗体滴度达1∶16 000。结论成功构建了高效表达的汉坦病毒S基因重组表达载体,获得了纯度较高具有较好的免疫原性与免疫反应性的核蛋白,为后续汉坦病毒单克隆抗体的制备奠定了基础。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。     

人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析

目的 构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3'末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白(Tat-cct)的免疫原性.方法 用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸)移位至Tat基因的3'末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化.以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析.结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000.Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1～101位氨基酸)均呈特异性结合反应.结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达.并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论.     

Identification of effective constituents of influenza vaccine by immunization with plasmid DNAs encoding viral proteins

The use of plasmid DNA encoding influenza viral proteins to vaccinate animals constitutes a promising approach to the development of effective subunit vaccines. This review describes the results obtained by the immunization of mice with such plasmid DNAs. (i) Both hemagglutinin (HA)- and neuraminidase (NA)-expressing DNAs for the surface glycoproteins from A/PR/8/34 (H1N1) or B/Ibaraki/2/85 virus can provide the most effective protection against influenza A-type or B-type virus infection among the various viral protein-expressing DNAs tested in BALB/c mice. (ii) A mixture of plasmid DNAs encoding HA and NA can provide more effective protection against virus challenge than plasmid DNA encoding HA or NA alone in BALB/c mice. (iii) NA-DNA can provide protection against infection not only by homologous virus but also by drift viruses. (iv) HA-DNA from A/PR/8/34 (H1N1) virus provides significant protection only in BALB/c (H-2(b)) mice, whereas HA-DNA from B/Ibaraki/2/85 virus affords significant protection in BALB/c, B10 (H-2(d)), and C3H (H-2(k)) mice. NA-DNA from both A-type and B-type viruses provides significant protection in the three strains of mice. These results suggest that both HA and NA molecules should be used as vaccine components to provide effective protection against influenza A-type and B-type virus infection in genetically heterogeneous humans.     

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA（A/Anhui/1/2005）对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。     

呼吸道合胞病毒M2:81-95与热休克蛋白70L1融合蛋白的制备及其免疫原性

目的 构建呼吸道合胞病毒(RSV)CTL表位M2:81-95与热休克蛋白(HSP)70L1融合蛋白的重组质粒,原核表达后初步研究其免疫原性.方法 从SMMC7721细胞中克隆HSP70L1基因.PCR扩增M2:81-95基因片段,鉴定后构建质粒pET-HSP70L1-M2:81-95(pET-HSP70L1-M2).经PCR和酶切鉴定,转化E.coli BL21(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达HSP70L1-M2:81-95(HSP70L1-M2),Ni-螫合亲合层析纯化,梯度透析复性.用该蛋白免疫10只BAlB/c小鼠,ELISA榆测IgG抗体及其亚型.噻唑蓝(MTT)法榆测CTL杀伤活性.结果 成功构建重组质粒pET-HSP70L1-M2,并在E.coli中表达重组蛋白HSP70L1-M2,该蛋白诱导RSV及表位特异性的CTL活性,还诱导蛋白抗原特异性的IgG,为4.87±0.35、IgGl为5.53±0.28、IgG2a为4.40±0.21.且IgG1/IgG2a(1.26)的比例平衡,与PBS对照组的IgG,为0.33±0.17、IgG1为0.51±0.21、IgG2a为0比较,差异有统计学意义(t=3.512,3.681,5.856;P<0.05).结论 成功构建原核表达质粒pET-HSP70L1-M2,斤表达纯化获得重组蛋白,免疫小鼠后诱导RSV及表位特异性的CTL活性和辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2混合型应答.     

日本血吸虫肌钙蛋白T(SjTnT)基因克隆 表达及免疫保护效果评估

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫肌钙蛋白T （SjTnT） 编码cDNA, 评估重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果。方 方 法 法 利用PCR技术扩增SjTnT基因, 构建重组表达质粒pET28a （+） ?SjTnT并诱导表达, 用重组蛋白rSjTnT免疫BALB/c小 鼠制备免疫血清。利用免疫印迹试验 （Western blotting） 和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测rSjTnT诱导的免疫反应。采 用rSjTnT免疫小鼠, 评估其诱导的免疫保护效果。结果 结果 成功克隆、 表达了日本血吸虫SjTnT基因。Western blotting显 示rSjTnT能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别, 具有良好的免疫原性。rSjTnT能诱导小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。 动物免疫保护试验表明, rSjTnT能诱导小鼠产生33.89%的减虫率以及43.94%的肝脏减卵率。结论 结论 制备的rSjTnT在小 鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果, 为评估SjTnT的生物学功能奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒HA基因与沙门菌fljB基因的融合表达与鉴定

目的 研发基于鞭毛蛋白的新型甲型H1N1流感疫苗。方法 分别以鼠伤寒沙门菌SL7202基因组和含有甲型H1N1流感病毒HA基因的重组质粒pET-HA为模板, 通过 PCR扩增Ⅱ相鞭毛蛋白fljB和HA1-2基因,再通过overlap PCR将这两基因片段拼接成HA1-2-fljB,将其插入原核表达质粒pET30a(+),构建重组质粒pET-HA1-2-fljB,并转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3) 中,以 IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白HA1-2-fljB的表达。结果 正确构建出重组质粒pET-HA1-2-fljB,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,融合蛋白分子量约94 KD,并具有良好的免疫反应性,能强烈诱导HEK293-mTLR5细胞分泌IL-8。结论 成功表达具有TLR5生物学活性的融合蛋白HA1-2-fljB, 为研究甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min^-1.ml^-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。     

Antigen-presenting B cells and helper T cells cooperatively mediate intravirionic antigenic competition between influenza A virus surface glycoproteins.

Parenteral vaccination of BALB/c mice primed by infection with H3N2 variants of influenza A virus results in a reduced production of N2 antibody in response to homologous (H3N2) vaccine compared with the response to an H7N2 vaccine equal in N2 immunologenicity. We now have studied the interaction in vitro of purified splenic B and T lymphocytes from variably immunized mice to ascertain the cellular basis of the hemagglutinin (HA)-influenced antibody response to neuraminidase (NA). Assay of the proliferative response of T cells in B/T-cell mixtures stimulated by H3N1 (HA-specific) and H6N2 (NA-specific) reassortant (recombinant) viruses in vitro has enabled us to differentiate cellular responses to HA and NA antigens. Using a factorial design in analysis of B/T-cell mixtures, we have shown that: (i) intravirionic HA is dominant over NA in both B- and T-cell priming; (ii) an increase in H3-specific B cells occurs in mice administered boosters of H3N2 vaccine, and an increase in N2-specific B cells occurs in those given a booster of H7N2 vaccine; and (iii) memory B cells function as antigen-presenting cells and interact with memory helper T cells in the mediation of intravirionic HA-NA antigenic competition in favor of HA. The damping of response to the NA antigen in favor of HA with reinfection prohibits balanced immunologic response to the two antigens. The present studies define further the complex immunology of influenza virus infection.