布鲁氏菌多重荧光定量PCR方法的建立与应用北大核心CSCD

目的探讨应用多重荧光定量PCR方法检测待检者血液、血清以及环境样本中布鲁氏菌的价值。方法根据149名待测者的就诊情况进行分类,其中疑似组75人、治疗组74人。对收集的环境和待检者的样本应用多重荧光定量PCR方法检测,结果进行统计分析。将3对引物、探针的目的基因克隆到PUC57载体上制作阳性标准品,进行灵敏度检测和标准曲线的绘制。结果通过对149名待检者的样本进行荧光定量PCR检测,单重、双重和三重方法的阳性率分别为79.2%、34.2%和27.5%。单重与双重,单重与三重荧光定量方法的阳性率差异均有统计学意义,χ^(2)值分别为55.42和73.42,P<0.05。布鲁氏菌属的单重荧光定量PCR结果生成的标准曲线为y=-3.7732x+43.188,R^(2)=0.9953,线性关系良好,最低检测范围为101 copies/μL。经过多重荧光定量方法检测的环境样本结果全部为阳性。结论单重荧光定量PCR方法灵敏度较好,建议与血清学方法联合使用对高危人群进行定期筛查,三重荧光定量方法可以在一次实验中既能完成属水平的鉴定又能区分牛种和羊种布鲁氏菌,对于环境样品具有良好的扩增效果,2种方法对于布鲁氏菌病的预防控制具有重要作用。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

布鲁氏菌PCR鉴定方法的研究与应用

目的采用PCR、PCR SSCP方法对布鲁氏菌进行快速鉴定,并对其种、型鉴别。方法分析已发表布鲁氏菌属、种、型基因序列,寻找出不 同布鲁氏菌的种、型特异性碱基分布规律,设计特异性引物,用于布鲁氏菌属、种、型的鉴定;根据聚合酶链反应 单链构象多态性（PCR SSCP）分析原理,建立PCR SSCP方法,用于区分牛种A19疫苗株与其他型布鲁氏菌。结果所建立的PCR方法能高效、准确鉴定出布鲁氏菌,并能 对其种、型进行区分;PCR SSCP方法可将A19疫苗株从其他型布鲁氏菌中区分出来。结论利用PCR、PCR SSCP方法能快速、准确地进行布鲁氏 菌属、种、型以及疫苗株A19的鉴别,且简便、可靠,便于临床应用。     

多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因

目的为了判定霍乱弧菌是否携带相关毒力因子,研发一种快速、准确、特异检测霍乱弧菌3种毒素基因的多重荧光定量PCR方法。方法针对霍乱弧菌ctxA、ace、zot基因设计引物和探针,建立PCR体系,对70株霍乱弧菌分离株进行鉴定,采用直接测序方法对鉴定结果进行验证。结果建立的多重实时荧光定量PCR方法可同时准确、特异地鉴定霍乱弧菌菌体携带的3种毒素基因,不携带毒素基因的菌株均未出现阳性检测结果。菌体检测的最低检出限度ctxA基因：102 CFU/mL,ace基因和zot基因：10CFU/mL。构建了3种毒素相关基因阳性质粒,ace基因和zot基因的最低检出限度为10copies/μL,ctxA基因的最低检出限度为102 copies/μL,定量检测批间和批内的变异系数均小于5%;对70株霍乱弧菌分离株进行评价,结果显示其中40株（57.2%）携带ctxA毒素基因、31株（44.3%）携带ace毒素基因、46株（65.7%）携带zot毒素基因,通过测序方法验证,符合率达到100%。结论本文建立的多重实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性好、灵敏度高,为霍乱弧菌的现场流行病学调查和疫情监测提供了快速、可靠的鉴定工具。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法.方法 使用以布鲁氏菌bscp 31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果.结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探...     

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的 评价荧光定量聚合酶链式反应（FQ－PCR）检测恶性疟原虫的效果。方法 以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较。结果 恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ－PCR检出的阳性率分别为33．1％、38．5％和40．9％;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0．961。结论 FQ－PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值。     

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方-法的建立

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方-法。方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行 Realtime-PCR扩增,评价该方-法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方-法的敏感性。结果 本方-法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10² copies/μL和10³ copies/μL。该方-法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方-法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。     

多重荧光定量PCR对三种主要致病性曲霉菌的检测研究

目的 建立一种能同时鉴定烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌的多重荧光定量PCR诊断方法,并将之应用于侵袭性曲霉菌病的诊断研究.方法 构建多重荧光定量PCR方法,对该方法进行实验评价,并将之应用于侵袭性曲霉菌病患者的痰标本检测,初步评价该方法的临床诊断效能.结果 建立的多重荧光定量PCR方法,制定标准曲线,R2在0.989～0.999之间,斜率分别为-3.117、-3.583、-3.674;只与烟曲、黄曲、黑曲的DNA发生特异性反应,无非特异性扩增;最低检测浓度为1×102孢子/ml;重复性检测试验,获得Ct值标准差为0.12～0.20,变异系数为0.37％～0.80％;对分离自26例侵袭性曲霉菌病患者的56份深部痰标本进行检测,敏感率为85.7％(48/56),特异性为92.0％(46/50),阳性预测值为92.3％(48/52),阴性预测值为85.2％(46/54).结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法检测侵袭性曲霉菌病患者的深部痰标本有较高的敏感性、特异性和阴、阳性预测值,且快速、简便,将有助于侵袭性曲霉菌病的早期准确诊断.     

实时荧光定量PCR检测IL-8mRNA在大肠癌的表达

目的:探讨大肠癌组织IL-8 mRNA表达及其临床意义.方法:用实时荧光定量PCR检测56例大肠癌组织及癌旁正常组织IL-8 mRNA表达,分析IL-8mRNA表达与大肠癌临床病理因素之间的关系.结果:癌组织和癌旁正常组织IL-8 mRNA表达有显著差异(1.106±0.420 vs 0.792±0.374,P＜0.05).癌组织IL-8 mRNA表达与淋巴结转移、组织学类型、血管侵犯、肝转移及肿瘤病理分期密切相关,与肿瘤部位、肿瘤大小、及患者的性别和年龄等无关.结论:IL-8高表达同大肠癌生物学行为密切相关,可能与大肠癌的发生、发展及预后有关.     

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的评价荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测恶性疟原虫的效果.方法以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较.结果恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ-PCR检出的阳性率分别为33.1%、38.5%和40.9%;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0.961.结论FQ-PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值.     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立

摘要：目的 建立快速、高效、特异的定量水体中尾蚴的数量和检测水体中日本血吸虫尾蚴残余基因组DNA的方法,来评估水体受日本血吸虫尾蚴污染的程度。方法 根据日本血吸虫基因组DNA中的三个多拷贝序列Sjrh1.0（序列号：U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列（序列号：AY157226.1）和逆转录转座子SjR2的G55A序列（G55A）（序列号：AF412221.1）,设计常规PCR引物和荧光PCR引物,比较选取较好的靶序列建立SYBR GreenI 实时定量PCR方法,绘制尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线,并对疫水中日本血吸虫尾蚴残余的基因组DNA进行检测。结果 尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线有良好的线性关系,相关系数r2为0.9186,和重复实验的变异系数小于3%。结论 本方法特异性高,灵敏,可定量水体中尾蚴数,重复性好,对疫水检测有一定的预警作用。     

荧光定量PCR及其在消化道疾病中的应用

荧光定量PCR是一种新的核酸定量技术,该技术是在PCR反应系统中引入荧光标记探针,具有实时监测,灵敏性、特异性和精确性高的特点,不断消除原有PCR技术的不稳定及容易产生假阳性等缺陷, 在监测患者病情、预后、指导用药等方面有着广阔的应用前景。     

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的 建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较,探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法 以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标,根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针,建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果 液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同,约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10⁴ copies/μL～1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%～62.96%),重复性越差;实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%～4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论 和实时荧光定量PCR相比,液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势,后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、...     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立一种快速廉价的检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据空肠弯曲菌flaA、gyrA基因设计引物,建立空肠弯曲菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以flaA基因引物对空肠弯曲菌DNA进行实时荧光定量PCR,扩增曲线呈S形指数增长,大肠埃希菌等对照菌扩增阴性。方法的灵敏度为10CFU/ml菌悬液。结论建立的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、准确等特点,具有一定的使用价值。     

应用荧光定量PCR检测细菌性脑膜炎病原体DNA的研究

目的应用荧光定量PCR检测细菌性脑膜炎病原体DNA,并对脑膜炎奈瑟菌进行基因分群。方法提取脑膜炎患者脑脊液和血标本中待检菌DNA,采用荧光定量PCR扩增ctrA、bexA、lytA基因,对ctrA扩增阳性标本及部分流脑菌株进行基因分群。结果 685份脑脊液标本中19份检出脑膜炎奈瑟菌、8份检出肺炎链球菌、2份检出b型流感嗜血杆菌DNA基因片段;2份血清标本脑膜炎奈瑟菌DNA基因检测均为阳性。对ctrA基因扩增阳性标本进行A、B、C、W135、X及Y分群,有18份为C群,3份为B群;部分健康人群携带的流脑菌株有14份为B群,2份为C群,1份为X群。结论荧光定量PCR灵敏性高,检测快速,可用于细菌性脑膜炎病原体的检测、鉴别及对脑膜炎奈瑟菌的分群。     

贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立及对云南鼠标本检测

目的 建立贝氏柯克斯体荧光定量PCR方法并应用于云南省鼠标本的检测.方法 根据贝氏柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针,以克隆的ISlllla基因片断(485 bp)作标准DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与普通巢式PCR方法进行比较.采用2种方法对云南玉溪自然界采集的鼠各类标本进行检测分析,计算2种方法的检出率.结果 实时荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(cycle threshold,Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=-0.999),重复性测试Ct变异系数(coefficient of variation,CV)为0.25%～3.98%,灵敏度为巢式PCR的10倍.以其他立克次体和常见病原菌共26种DNA为模板进行特异性检测,结果均为阴性.实时荧光定量PCR检测鼠血、肝脏、脾脏中的贝氏柯克斯体,阳性率分别为32.31%、61.29%、85.19%;巢式PCR法检测相应标本阳性率分别为27.69%、11.29%、74.07%;间接免疫荧光试验检测鼠血清中贝氏柯克斯体IgG抗体阳性率为26.15%.结论 本实验建立的实时荧光定量PCR比巢式PCR敏感,且具有良好的特异性,可用于人群和动物贝氏柯克斯体感染监测及临床标本的检测.     

用核酸荧光定量PCR技术检测尖锐湿疣HPV的研究

对５０例病理诊断为尖锐湿疣（ＣＡ）的标本进行了核酸荧光定量ＰＣＲ检测,检出率为９６％。结果表明：核酸荧光定量ＰＣＲ可一次性完成对尖锐湿疣ＨＰＶ感染的检测,检测覆盖面宽,漏检率低,对尖锐湿疣的诊断有较好的应用价值。