胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响*☆

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。 目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。 方法：取孕14 d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。 结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。关键词：胰酶;胶原酶;神经干细胞;细胞培养;鉴定;胎鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.019      

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景：目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高。 目的：观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养。 方法：采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1∶1∶1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37 ℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养。 结果与结论：倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12 h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72 h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应。说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

原代人宫颈癌细胞的培养方法

背景：在体外分离、培养宫颈癌上皮细胞, 从细胞水平及分子水平研究肿瘤病因及治疗的基础,是宫颈癌组织工程研究的最基本环节。 目的：探讨适用于组织工程宫颈癌研究的人宫颈癌原代细胞培养方法以及传代后细胞形态变化、增殖的特性。 方法：0.25%胰蛋白酶和2%Ⅰ型胶原酶联合消化法体外培养宫颈癌原代细胞,荧光倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态、体外生长情况,免疫组化法检测体外培养宫颈癌细胞表面标记物CK17和肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达。 结果与结论：采用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞,该法相对简单且重复性较好,所得到的原代细胞纯度较高。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型。宫颈癌细胞表面标记物CK17阳性表达,证实细胞为上皮源性,肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性。     

人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定*

背景：由于肿瘤存在个体差异,对癌株的研究不能准确反映个体之间的差异,原代细胞培养则与体内状态更相近。 目的：体外培养建立宫颈癌细胞原代培养方法。 方法：采用胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法从23例新鲜宫颈癌组织获取宫颈癌细胞,测定其细胞生长曲线,并用免疫荧光染色检测细胞表面标记物CD44、CK17进行鉴定。 结果与结论：23例中有21例成功从宫颈癌组织中获取宫颈癌细胞并能连续传代,稳定增殖,免疫荧光染色显示宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性。说明胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法能成功分离原代宫颈癌细胞。 关键词：原代培养;鳞状上皮细胞;宫颈癌;增殖;胰蛋白酶 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.014     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)原代培养、传代及鉴定的方法.方法 采用肾小管节段贴块培养法与3种消化培养法(胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA、胶原酶Ⅰ)进行小鼠肾小管上皮细胞原代培养,锥虫蓝染色后镜下观察消化后细胞成活率、细胞形态和数量.胰蛋白酶消化传代,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类.结果 贴块法和胶原酶Ⅰ消化培养法均能成功培养小鼠肾小管上皮细胞,两者相比,胶原酶Ⅰ消化培养法培养的细胞生长更快.结论 胶原酶Ⅰ消化培养法是小鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代培养及生物学特性比较研究

目的：建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ) 的改良体外原代培养法，并对其生物学特性进行比较研究。方法：AECⅡ用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离后，接种于大鼠免疫球蛋白G （IgG）包被的培养瓶黏附纯化。将获得的AECⅡ用碱性磷酸酶(AKP) 、电镜和肺表面活性物质相关蛋白A(SPA) 免疫细胞化学方法进行鉴定，并对它的SPA表达和转染特性与AECⅡ来源A549细胞进行比较研究。结果：胰蛋白酶和胶原酶消化加IgG黏附纯化后所得的AEC Ⅱ,产量为2×107-3×107，纯度为75%-84%，细胞活力93％以上，AKP 染色快捷简便。AECⅡ 同A549细胞 相比具有某些不同的特性。结论：采用IgG黏附纯化能提高AECⅡ纯度，AKP 染色简便实用。对于AECⅡ 细胞的某些特性研究发现其并不能完全用A549细胞系来代替。     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景：组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞。 目的：建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法。 方法：小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3β-羟基固醇脱氢酶染色方法。 结果与结论：小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好。说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型。     

新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

目的：本文建立了一种肌卫星细胞的纯化培养方法，并对其进行了鉴定。方法：①肌卫星细胞的分离培养：取3日龄SD大鼠，取大腿肌组织，用Hanks液冲洗，剪碎后加入0．5％胶原酶Ⅱ，0．1％透明质酸酶，37℃消化20分钟。400目尼龙网过滤，190g离心清洗3次。加入1％链酶蛋白酶(pronase)37℃消化20分钟。     

晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化

背景：间充质干细胞是组织工程中常用的种子细胞,而来源于人膝关节滑膜组织的间充质干细胞能否作为骨组织修复与再生中合适的种子细胞还需要进一步验证。 目的：观察晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源的间充质干细胞体外向成骨细胞定向分化的潜能,对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。 方法：无菌条件下从行全膝关节置换的晚期骨关节炎患者膝关节腔内获取滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化分离获得有核细胞。以最适密度接种(200个有核细胞/cm2),挑选单细胞克隆,筛选出滑膜间充质干细胞。基础培养基培养,传至第3代时改换为含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的成骨诱导培养基诱导培养。 结果与结论：体外分离培养的滑膜间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长。传代至第3代,细胞呈成纤维细胞样生长,形态均一。滑膜间充质干细胞成骨诱导后呈典型的“铺路石样”成骨细胞形态,诱导至第7天碱性磷酸酶染色呈强阳性,碱性磷酸酶活性表达也在诱导7 d时达最高峰;诱导21 d茜素红染色可见大量钙结节形成;同时反转录PCR检测到Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达在诱导后增加,21 d时表达最高。从晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织分离获得的滑膜间充质干细胞,在体外可成功诱导分化为成骨细胞,所诱导生成的细胞具有典型的成骨细胞特性。提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程理想的种子细胞来源,在骨组织的再生修复中发挥重要作用。     

滑膜间充质干细胞分离培养、免疫表型鉴定及在混合淋巴反应体系中的抑制效应*

背景：滑膜组织中可分离出具有多向分化潜能干细胞特性的细胞。  目的：探索滑膜间充质干细胞体外分离、培养的可行性、免疫表型的鉴定及对混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖的影响,评价其免疫学特性。  方法：关节镜下获取10例半月板损伤患者的膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞。挑选单细胞克隆,筛选获得滑膜间充质干细胞。检测其增殖能力、细胞活力,流式检测其细胞免疫表型,采用人双向混合淋巴细胞反应体系及植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖反应体系,根据滑膜间充质干细胞与外周血单个核细胞的不同比例加入丝裂霉素处理滑膜间充质干细胞。MTT法检测并计算其抑制率。 结果与结论：10组滑膜间充质干细胞系增殖能力和细胞活力差异无显著性意义(P > 0.05)。10组细胞系免疫表型：CD44、CD90、CD105呈阳性,CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性。滑膜间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应体系中及植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖反应体系中淋巴细胞的增殖、抑制率与加入的滑膜间充质干细胞数量成正比。提示关节滑膜组织可以分离、培养获得滑膜间充质干细胞,其具有间充质干细胞特异性表型,且滑膜间充质干细胞具有免疫调节作用。      

犬关节软骨细胞的体外分离与培养

背景：自1967年Manning等提出的通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞以来,软骨细胞的体外分离培养研究较多,但目前尚无统一标准。 目的：研究犬关节软骨细胞在体外分离以及培养的条件,寻求体外扩增软骨细胞较简便、可行、高效的实验方法。 方法：取3周龄幼犬关节软骨组织,应用胰酶、胶原酶制定8种消化方法获取软骨细胞,对比不同方法所获取细胞数量及细胞成活率,分离细胞进行原代及传代培养,观察各代软骨细胞形态。 结果与结论：在体外分离犬关节软骨细胞的各种方法中,单纯应用Ⅱ型胶原酶消化法获得的软骨细胞数最多,细胞成活率最高。软骨细胞可以通过体外培养获得扩增,并且维持良好的细胞形态及表型,但仅限于5代以内。     

改良的心肌微血管内皮细胞分离培养方法

目的:建立一种细胞获得率高并且操作简单的心肌微血管内皮细胞体外培养体系。方法:无菌条件下分离左心室,0.1%胶原酶消化6min后,加0.1%胰蛋白酶继续消化4min,用100μm滤网过滤消化液,离心收集滤液中血管段进行培养。用内皮细胞的重要标记物VIII因子相关抗原鉴定细胞,并通过3H-TdR掺入法观察培养细胞对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的反应性。结果:细胞的获得率为1.2×106细胞/g心肌组织,显微镜观察培养细胞具有内皮细胞生长特性:单层“卵石样”排列特征;VIII因子免疫细胞化学染色呈阳性;证实获得的是内皮细胞。bFGF刺激后3H-TdR掺入率与对照组比较差异显著(P<0.05)。结论:本研究利用改良的酶消化法,缩短了消化时间,提高了细胞获得率,同时培养的内皮细胞对生长因子具有良好反应性,表明该方法是一种比较理想的体外心肌微血管内皮细胞培养体系。     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景：移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。 目的：探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。 方法：培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。 结果与结论：①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24 h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72 h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48 h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

Isolation of cardiomyocytes from human myocardium for primary cell culturing

Summary Maximizing the yield of viable cardiomyocytes suitable for primary cultures is important in the processing of small human myocardial biopsies. The purpose of this study was to establish the conditions of collagenase and trypsin digestion of ventricular myocardium to obtain optimal yields of viable cardiomyocytes. Our results showed that calcium in the digestion solution was toxic to the cells. EDTA chelated calcium in the digestion solution and inhibited collagenase activity. Trypsin increased collagenase activity, especially in the presence of EDTA. The combination of trypsin and collagenase with or without EDTA was more effective than either enzyme alone in increasing cardiomyocyte yield and viability and in minimizing cardiomyocyte damage. By repeating the digestion of a 5 to 20-mg myocardial biopsy, sufficient numbers of viable cardiomyocytes can be obtained for primary culture.     

机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

文题释义： 流式细胞分析技术：简称流式细胞术,是20世纪70年代初发展起来的一种在功能水平上可以对单个细胞或其他生物离子进行快速定量的一项新型分析技术和分选技术。它能够在短时间内高速分析上万个细胞,可以同时测量如细胞或粒子的体积、内部结构以及膜电位变化等生物或化学性质,进行多信息分析,具有快速、高灵敏、准确、多参数等特点。 单细胞悬液：是进行细胞体外培养和流式细胞分析的基础,即将组织分散成单个游离细胞,使其悬浮在液体培养基中,当然如外周血及骨髓标本等本身即为天然的单细胞悬液,这些细胞经过简单处理,就可以应用于流式分析、细胞分选、细胞培养等实验。如果2个或多个细胞粘连在一起或细胞碎片过多都将影响流式分析结果,进而导致实验失败。 背景：流式细胞术作为目前先进的细胞分析技术,其研究基础是单细胞悬液,但目前尚无有关膈肌组织单细胞悬液制备方法的相关报道。 目的：探索应用机械法与机械-酶消化法分别制备大鼠膈肌单细胞悬液的可行性并比较2种方法获得单细胞的数量和活性。 方法：以SD大鼠的新鲜膈肌组织为标本,在机械法的基础上,选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ及其不同组合进行消化制备膈肌单细胞悬液,观察细胞形态并经锥虫蓝染色后测定细胞活性,对活细胞、失活细胞和细胞团块进行计数并计算出细胞存活率和单细胞悬液浓度,结果进行统计学比较分析。 结果与结论：①机械-酶消化法所制得的单细胞悬液较机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净;②单纯机械研磨法制备的单细胞悬液活细胞数较低,失活细胞数较高,细胞存活率最低,团块较多;③在机械法的基础上,加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶所得单细胞悬液的活细胞数及悬液浓度最高,每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞,细胞存活率较高,与单纯机械法获得单细胞悬液比较,在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及悬液浓度方面差异均有显著性意义(P < 0.05);其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法,所得单细胞悬液浓度、细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想;④结果表明,机械法和机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液,机械-酶消化法优于单纯机械法,其中加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶的机械-酶消化法所得单细胞悬液效果最佳,是较优选的膈肌单细胞悬液制作方法。 ORCID: 0000-0002-4486-5917(张远圆) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程