兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养

背景：兔来源的骨髓间充质干细胞是具有较强的体外增殖和多系统分化潜能的成体干细胞,在组织工程及生物治疗领域蕴藏着巨大的潜能。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察骨髓间充质干细胞的生物学特征。 方法：无菌条件下抽取兔骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。在显微镜下观察细胞形态特征及生长规律,流式细胞技术检测细胞表面抗原标记物的表达。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经过细胞传代后能够获得进一步纯化的细胞,杂质细胞减少。原代细胞形态即呈现三角形、长梭形、纺锤形的贴壁细胞特征。第 5代骨髓间充质干细胞呈典型的极性漩涡状生长,形态单一均匀,不具有表达造血前体细胞表面标志抗原CD34和白细胞表面标志抗原CD45的表面标记物功能,但是具有能够表达出整合素家族的成员 CD29 及黏附分子CD44的特点。说明经全骨髓贴壁法和Percoll密度梯度离心法体体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经流式细胞分析鉴定为兔骨髓间充质干细胞。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究。 目的：通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能。 方法：利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达。分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。 结果与结论：原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96 h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8 d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快。流式细胞检测 CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%。不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能。     

热休克汗腺细胞诱导人骨髓间充质干细胞的表型转化

背景：未休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的共培养和休克汗腺细胞与骨髓间充质干细胞的直接共培养均对骨髓间充质干细胞的表型改变无影响。 目的：在体外建立热休克汗腺细胞模型和骨髓间充质干细胞与汗腺细胞间接共培养体系;分析共培养前后骨髓间充质干细胞的形态学、细胞表型的变化情况,探讨骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化的可行性。 方法：体外分别分离培养、扩增并鉴定骨髓间充质干细胞和汗腺细胞,建立汗腺细胞体外热休克模型,继续孵育3-5 d,收集上清液作为条件培养基对骨髓间充质干细胞分化诱导,对比共培养5,10 d骨髓间充质干细胞形态学变化;应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后骨髓间充质干细胞细胞表型的改变。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞表面标志 CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志CK7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性。②骨髓间充质干细胞诱导分化后细胞表型的改变：被诱导的细胞中CEA、CK7、CK8和CK19 染色阳性,而对照组没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞;流式细胞仪检测CEA、CK7、CK8和CK19的阳性率分别是60.67%,53.34%,54.11%和58.62%。说明实验成功诱导骨髓间充质干细胞,并获得汗腺细胞表型;通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的骨髓间充质干细胞可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺细胞。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景:骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的:进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论:成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓间充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

人羊水来源干细胞生物学性状的研究

目的对人羊水标本进行体外分离培养,建立人羊水来源干细胞的体外培养体系,对其生物学形状进行研究。方法贴壁法体外分离获得人羊水来源干细胞,多次传代扩增后,采用流式细胞仪和RT-PCR技术检测细胞表面抗原的表达。结果羊水干细胞原代生长较慢,传代后生长迅速,体外倍增时间约36h,流式细胞仪检测证实细胞表达CD29、CD44、CD105等间充质干细胞标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD133。RT-PCR检测显示羊水干细胞表达Oct-4、Nanog基因。结论实验成功分离获得羊水中具有干细胞性质的细胞群,采用贴壁法分离获得的干细胞体外增殖能力强,表达间充质干细胞表面标志,符合间充质干细胞的特点。     

牙胚组织中可分离得到大量间充质干细胞

背景：已经有研究从牙髓、牙囊和牙周组织中分离得到间充质干细胞。牙胚是牙的前体,能否从中直接分离间充质干细胞,目前未知。 目的：从人流产胎儿牙胚中分离间充质干细胞,检测其生物学特征。 方法：无菌条件下挖出水囊流产胎儿牙床中的整个牙胚,剪碎后分别用胶原酶Ⅱ和胰酶消化,过滤除去颗粒物后,细胞悬液用培养液洗涤,培养、扩增得到贴壁细胞,进行细胞形态学观察、免疫表型测定和多向分化功能鉴定。 结果与结论：经过3次传代后,从单个胎儿牙胚中即可获得超过10⁷形态均匀的、梭形贴壁细胞,其表达CD105、CD73、CD90和CD44等表面标志,不表达CD34、CD45标志;在体外向成骨、成脂分化,在体内可以分化为软骨细胞。提示用贴壁法可从人胎儿牙胚中分离得到大量的间充质干细胞。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定***☆

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。 目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。 方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。 结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1∶3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。 关键词：单克隆培养;骨髓基质干细胞;多能成体干细胞;鉴定;分化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.008     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。 目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。 方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。 结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性****☆

背景：体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。 目的：采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。 方法：通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。 结果与结论：采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49) h;细胞周期分析表明：G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

贴壁和缩短胰酶消化时间培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景：对于骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增目前已有几种方法,各自均有不同的优劣性。 目的：观察贴壁法和缩短胰酶消化时间的方法体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞的特点。 方法：培养初期频繁换液,去除混杂细胞;传代后加入不同诱导剂定向诱导分化,使之分别向脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞方向分化。 结果与结论：该分离培养方法在第3代可以得到纯化的骨髓间充质干细胞。分离培养的细胞纯度高,有良好的增殖和分化潜能。定向诱导培养的细胞能向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞方向分化。     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。 目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。 方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。 结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。 目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。 方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。 结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%)。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。 目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。 方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,Von Kossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。 结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14~21天,两组的Von Kossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。