PcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1疫苗免疫效果的影响

目的观察pcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1DNA疫苗免疫效果的影响。方法从烫伤小鼠肺部组织细胞中提取总RNA进行RT-PCR扩增;将扩增产物与pGEM-T载体连接,构建mIL-18原核表达质粒pGEM-T/mIL-18,酶切纯化mIL-18片断,构建真核表达质粒pcDNA3/mIL-18,将其作为基因佐剂和pcDNA3/VP1共免疫BALB/c小鼠。结果3次免疫后,共免疫组中和抗体滴度高于pcDNA3/VP1组;而病毒滴度低于pcDNA3/VP1组。用10LD50CVB3攻击后,共免疫组小鼠生存率为35%,高于pcDNA3/VP1组。结论PcDNA3/mIL-18对pcDNA3/VP1DNA疫苗的免疫效果有一定的增强作用。     

柯萨奇B2病毒VP1基因疫苗诱导细胞免疫的初步研究

目的　构建柯萨奇B2 病毒 (CVB2 )VP1侯选基因疫苗 ,评价其诱导细胞免疫的效果。方法　采用逆转录PCR技术扩增CVB2 的主要中和抗原VP1基因 ,通过分子克隆构建 pcDNA3 CVB2 VP1基因免疫质粒并免疫BALB/c小鼠 ,51Cr释放法测定CTL杀伤效应。结果　基因免疫质粒表达载体为 pcDNA3 ,亚克隆片段为CVB2 VP1,pcDNA3 CVB2 VP1接种组CTL特异性杀伤百分率均高于 pcDNA3 组 (P <0 0 1) ,E/T为 5 0∶1时特异性CTL杀伤百分率最高 ,为 (31 2± 6 8) % (P <0 0 5 )。结论　pcDNA3 -CVB2 VP1可诱导小鼠产生细胞免疫。     

白细胞介素2和15基因对柯萨奇病毒VP1 DNA疫苗诱导免疫应答的影响

目的:观察白细胞介素2(IL 2)、白细胞介素15(IL 15)基因对柯萨奇病毒(CVB3)VP1DNA疫苗诱导 免疫应答的影响,以及该疫苗在小鼠受到致死量CVB3攻击时的保护作用。方法:采用雄性4～6周龄Balb/c小 鼠100只,随机分为5组,并分别肌内注射0.9%氯化钠溶液、pcDNA3、pcDNA3 VP1、pcDNA3 VP1加pcDNA3 IL 2和pcDNA3 VP1加pcDNA3 IL 15,每周注射1次,共3次,每次免疫后第6天取血清,用微量中和试验检测 CVB3中和抗体,3次免疫后用800TCID50CVB3感染小鼠,观察小鼠的生存时间和生存率。结果:pcDNA3 VP1、pcDNA3 VP1加pcDNA3 IL 2、pcDNA3 VP1加pcDNA3 IL 15组均诱导小鼠产生了中和抗体,抗体滴度 随免疫次数增加而提高。病毒攻击后,各组的生存率差异无统计学意义,pcDNA3 VP1加pcDNA3 IL 2、pcD NA3 VP1加pcDNA3 IL 15组较其他3组生存时间明显延长。结论:IL 2、IL 15基因对CVB3VP1DNA疫苗诱 导小鼠产生免疫应答和免疫保护有一定的增强作用。     

柯萨奇B2病毒VP1基因疫苗诱导细胞免疫的初步研究

目的构建柯萨奇B2病毒(CVB2)VP1侯选基因疫苗,评价其诱导细胞免疫的效果.方法采用逆转录PCR技术扩增CVB2的主要中和抗原 VP1基因,通过分子克隆构建pcDNA3-CVB2VP1基因免疫质粒并免疫BALB/c小鼠, 51Cr释放法测定CTL杀伤效应.结果基因免疫质粒表达载体为pcDNA3,亚克隆片段为CVB2VP1,pcDNA3-CVB2VP1接种组CTL特异性杀伤百分率均高于pcDNA3组(P＜0.01),E/T为50∶1时特异性CTL杀伤百分率最高,为(31.2±6.8)%(P＜0.05).结论 pcDNA3-CVB2VP1可诱导小鼠产生细胞免疫.     

汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因的DNA免疫

目的　将编码汉坦病毒浙 37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒免疫小鼠 ,观察其能否诱导体液免疫应答。方法　重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2以不同方式免疫BALB/C小鼠 ,用免疫荧光测定 (IFA)法检测血特异性抗体 ,用半微量直接免疫酶斑减少中和试验检测血中和抗体。经肌内注射途径免疫 15只BALB/C小鼠 ,3组小鼠分别注射 10 0 μgpcDNA3.1、pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2 ;每只小鼠免疫 3次 ,初次免疫后 4周 ,加强 2次 ,间隔 3周。经基因枪免疫 9只BALB/C小鼠 ,3组小鼠分别注射 1.5 μgpcDNA3.1、pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2 ;每只小鼠免疫 2次 ,初次免疫后 4周 ,加强 1次。结果　 1.经肌内注射免疫时 ,产生特异性抗体的小鼠个数分别是 :pcDNA3.1 G1组为 5只中 3只 ,pcDNA3.1 G2组为 5只中 2只 ;荧光抗体滴度 1∶2 0～ 1∶80 ;产生中和抗体的小鼠个数分别是 :pcDNA3.1 G1组为 5只中 1只 ,pcDNA3.1 G2组为 5只中 2只 ;中和抗体滴度 1∶10～ 1∶2 0。 2 .经基因枪免疫时 ,实验组小鼠都产生了特异性抗体和中和抗体。荧光抗体滴度 1∶2 0～ 1∶32 0 ,中和抗体滴度≥ 1∶10。结论　重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2能诱导小鼠产生有效的体液免疫应答     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的用所构建的弓形虫pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答.方法碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1质粒,免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射100ug, 两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.于免疫后第50天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清IgG抗体90天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异.结论 pcDNA3-ROP1质粒DNA免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生IgG抗体.     

SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

融合基因DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1对柯萨奇病毒B组3型的免疫效果

目的:观察巨噬细胞源趋化因子(MDC)基因与柯萨奇病毒B组3型(CVB3)VP1基因融合基因DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,为CVB3疫苗的研制提供理论和实验依据。方法:6~8周雄性BALB/c纯系小鼠156只随机均分为6组,分别肌内注射0·9%氯化钠溶液(A组)、pcDNA3(B组)、pcDNA3/MDC(C组)、pcDNA3/VP1(D组)、pcDNA3/MDC加pcDNA3/VP1(E组)、pcDNA3/MDC-VP1(F组),3周注射1次,共3次。每次接种后20d断尾取血,测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组20只小鼠腹腔注射含10倍半数致死量LD50的CVB3的病毒液各0·2ml,观察各组小鼠的存活情况;每组剩余的6只小鼠腹腔注射含3倍LD50的病毒液各0.2ml,第7天取血后处死,用于检测血中病毒滴度,称量心脏质量计算心脏体重比。结果:A、B、C、D、E和F组的生存率分别为15%、10%、20%、25%、35%和50%,用Kaplan-Meier进行生存分析表明,F组(pcDNA3/MDC-VP1组)的生存状况好于其他各组;F组的血清中和抗体滴度明显提高、血中病毒滴度显著降低,心肌充血肿胀程度较轻。结论:融合基因DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1能诱导小鼠对CVB3VP1产生更强的免疫应答,提高小鼠生存率。     

微小隐孢子虫CP23 DNA疫苗免疫保护作用研究

目的研究微小隐孢子虫表面抗原CP23 DNA疫苗产生的免疫反应及对小鼠的免疫保护作用。方法选BALB/c小鼠60只,随机分为3组,即疫苗免疫组、PBS对照组及空质粒对照组。疫苗免疫组用构建的真核表达质粒pcDNA 3.0-23每隔2周免疫1次小鼠,共免疫3次。PBS对照组肌注等量PBS,空质粒对照组肌注pcDNA3.0,免疫方法及次数同疫苗免疫组。末次免疫2周后,分别取小鼠脾脏、血清,检测CD4+和CD8+T细胞、细胞因子IFN-γ及抗CP23特异性抗体IgG和IgA滴度;用微小隐孢子虫攻击感染被免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果 PBS对照组及空质粒组比较,疫苗免疫组小鼠的CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值及脾细胞培养上清中IFN-γ滴度均显著升高(P0.05),小鼠血清抗CP23特异性抗体IgG及IgA滴度随免疫次数增加显著升高(P0.05),攻击感染后小鼠排卵囊量显著减少(P0.05),且排出时间缩短。结论构建的微小隐孢子虫表面抗原CP23真核表达质粒能够诱导小鼠产生细胞及体液免疫反应,对小鼠有较好的免疫保护作用。     

细粒棘球绦虫Eg95基因疫苗和重组抗原诱导小鼠免疫应答的比较研究

目的观察比较细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗诱导小鼠的免疫应答状况。方法实验组和对照组小鼠分别注射Eg95重组抗原(rEg95)、费氏佐剂(FCA)、pcDNA3-Eg95基因疫苗、pcDNA3质粒和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测抗体IgG和IgG2a亚类水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应。结果rEg95免疫组小鼠在第二次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1∶25,600。Eg95基因疫苗免疫的小鼠产生抗体滴度随免疫次数的增加而升高,最高可达1∶3,200,但是低于Eg95重组蛋白免疫小鼠产生的抗体滴度水平。pcDNA3-Eg95免疫组产生IgG2a亚类抗体水平明显高于对照组和rEg95组。在第四次免疫后,进行淋巴细胞转化试验,MTT法检测证实rEg95和pcD-NA3-Eg95免疫的小鼠,其脾细胞均可在体外被特异性刺激增生。结论细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗均可诱发小鼠产生特异性免疫应答。     

丙型肝炎病毒核心基因免疫诱生细胞免疫应答研究

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫在诱生特异性细胞免疫应答中的作用。方法 将包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的重组真核表达质粒ｐｃＣＮＡ ＨＣＶ Ｃ,在主宰其可以在小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０（Ｈ－２^d）中表达之后,注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌。ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体水平;^3Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠脾细胞特异性增殖能力;^51Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能。结     

金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌Flic融合蛋白的构建与免疫原性研究

目的 探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium, S.typhimurium)鞭毛蛋白融合蛋白的免疫保护作用。方法 将纯化的Flic-GapC融合蛋白背部皮下接种免疫小白鼠,间隔3周免疫两次。应用间接ELISA方法测定小鼠血清中IgG抗体滴度;在二次免疫后2周,分离小鼠脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖实验,利用Elispot方法检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞;在二免后3周,用S. aureus Wood46 株对免疫小鼠进行腹腔注射攻毒,观察1周并记录小鼠死亡数目。结果 融合蛋白能够诱导小鼠产生特异性的免疫应答,二免后14 d血清中IgG抗体滴度达到最高(1∶64 000),淋巴细胞刺激指数、分泌IFN-γ和IL-4的细胞数与对照组相比升高(P<0.05),对S. aureus的保护率达到70%。结论 Flic-GapC融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可作为S. aureus的疫苗靶向进行深入研究。     

表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗的免疫学特性

目的测定表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只),将表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的两种重组质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF分别免疫小鼠3次,每次间隔2周,同时设卡介苗(BCG)免疫组、空载体质粒免疫组和生理盐水对照组。最后一次免疫结束后,每组取5只小鼠血清,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗体的滴度,并分离小鼠的脾淋巴细胞,并在体外用结核分枝杆菌(MTB)培养滤液蛋白(cu lture filtrate prote in,CFP)刺激,测定脾淋巴细胞增殖指数和γ干扰素(IFN-γ)水平。用1 m l含1×105克隆形成单位(CFU)的MTB毒株H37Rv经尾静脉感染其余每组5只BALB/c小鼠,4周后计数脾脏细菌负荷数。结果质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1∶1 000和1∶1 500。其脾淋巴细胞刺激指数分别为2.2和2.4,而生理盐水对照组和空载体质粒免疫组的刺激指数只有0.9和1.1;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ分别为(5.48±0.38)ng/m l和(5.76±0.51)ng/m l,显著高于生理盐水对照组和空载体质粒免疫组(P<0.05),但与BCG免疫组的(5.55±0.31)ng/m l比较差异无统计学意义。结核毒株攻击后,与空载体质粒免疫组相比,质粒AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF免疫的BALB/c小鼠其抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,3组脾脏细菌负荷对数值(lg,CFU/g)分别为6.08±0.25、4.63±0.11、4.50±0.32,但不及BCG免疫组的4.09±0.27。结论表达Ag85B与ESAT6融合蛋白的基因疫苗在小鼠体内诱导的IFN-γ水平与BCG相当,其保护力有待进一步提高。     

免疫刺激序列增强日本血吸虫DNA疫苗的免疫保护作用

目的　探讨免疫刺激序列在日本血吸虫Mr 23 000膜蛋白 (SjC23)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗血吸虫感染中的作用。　方法　将SjC23基因片段克隆到增加了免疫刺激序列的真核表达质粒 pcDNA3.1-CpG中,构建pcDNA3.1-SjC23/CpG。 40只雌性BALB/c小鼠随机分为 4组 ,① pcDNA3.1对照组 ;②pcDNA3.1-SjC23组 ;③ pcDNA3.1-CpG组 ;④ pcDNA3.1-SjC23/CpG组。每鼠经两侧股四头肌注射质粒DNA共100 μg ,隔 2周加强免疫 1次 ,共 3次。末次免疫后 4周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴 45条 /鼠 ,45d后计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前和感染前 2d分别经尾静脉采血 ,检测IgG及IgG1、IgG2a。末次免疫后 3周取小鼠脾细胞 ,检测经伴刀豆球蛋白和SjC23重组蛋白刺激后小鼠白细胞介素 2 (IL-2 )、白细胞介素 4(IL-4)和γ干扰素 (IFN-γ)。用51Cr释放法检测经SjC23重组蛋白刺激后脾细胞对小鼠淋巴瘤细胞的杀伤作用。　结果　②组和④组减虫率分别为 2 8.1%和 3 5.1% ,减卵率分别为 2 1.6%和 2 6.5 %。④组减虫率显著高于②组 (P <0.0 5 )。这两组均检测到特异性IgG ,IgG2a/IgG1比值分别为 10.1和 12.2。脾细胞经伴刀豆球蛋白和SjC23重组蛋白刺激后的IL-2水平 ,②组较①组、④组较③组均有升高。②组脾细胞对靶细胞的杀伤活性为9.7%, ④组为40.0%。 结论 疫苗载体中增加免疫刺激序列，可提高SjC23 DNA 疫苗在BALB/c小鼠中诱导产生的免疫保护作用。     

Novel DNA vaccine based on hepatitis B virus core gene induces specific immune responses in Balb/c mice

AIM:To investigate the immunogenicity of a novel DNA vaccine,pSW3891/HBc, based on HBV core gene in Balb/c mice. METHODS:A novel DNA vaccine, pSW3891/HBc, encoding HBV core gene was constructed using a vector plasmid pSW3891. Balb/c mice were immunized with either pSW3891/HBc or empty vector DNA via gene gun. IgG anti-HBc responses in mouse sera were demonstrated by ELISA. Specific cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) of mice was quantitatively measured by lactate dehydrogenase release assay. RESULTS:HBcAg was expressed effectively in 293T cell line transiently transfected with pSW3891/HBc. Strong IgG anti-HBc responses were elicited in mice immunized with pSW3891/HBc. The end-point titers of anti-HBc reached the highest 1:97 200, 4 wk after the third immunization. The specific CTL killing with the highest specific lysis reached 73.25% at effector:target ratio of 20:1 in mice that received pSW389l/HBc DNA vaccine. CONCLUSION:pSW3891/HBc vaccination elicits specific anti-HBc response and induces HBc-specific CTL response in immunized Balb/c mice.     

磷酸铝佐剂对乙型肝炎DNA疫苗抗体应答的增强作用

目的 探讨磷酸铝佐剂对乙型肝炎DNA疫苗诱导体液免疫应答的增强作用。 方法 应用基因重组技术构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)真核表达质粒pcDNA 3.1-S,经酶切和测序鉴定无误后,作为乙型肝炎DNA疫苗,将不同浓度的磷酸铝悬液与之混合后免疫小鼠;用酶联免疫吸附法检测重组质粒在小鼠局部肌肉中HBsAg的表达和在血清中HBsAg的含量;并于免疫小鼠6周后检测小鼠血清抗-HBs水平。 结果 与单纯使用质粒pcDNA 3.1-S相比,将质粒pcDNA 3.1-S与磷酸铝悬液混合后免疫小鼠,重组质粒在小鼠局部肌肉中HBsAg表达差异无显著性;HBsAg在血清中的浓度均为阴性。将质粒pcDNA3.1-S与磷酸铝悬液混合后免疫小鼠,6周后检测小鼠血清抗-HBs,每1μl质粒中含1、10、50、100 μg磷酸铝组,小鼠血清抗-HBs抗体的P/N值分别为11.00±6.62、20.30±10.20、49.1 8±24.40和48.68±27.78,单纯使用质粒pcDNA3.1-S组P/N值为11.54±5.60。含1μg和10μg磷酸铝组,抗-HBs抗体P/N值与单纯用质粒pcDNA3.1-S组相比,差异无显著性;50μg和100μg磷酸铝组抗-HBs抗体P/N值高于单纯用质粒pcDNA3.1-S组,但50μg和100μg磷酸铝组二者差异无显著性。 结论 磷酸铝与质粒pcDNA3.1-S混合对pcDNA3.1-S在小鼠局部肌肉中HBsAg的表达无明显增强作用,但一定含量的磷酸铝能显     

乙型肝炎病毒S基因与C基因免疫小鼠诱生的免疫应答

目的 观察小鼠对HBV S基因和基因疫苗的应答。方法 用已构建的HBV S基因疫苗(pCR3.1-S)和C基因疫苗(pCR3.1-C)分别给Balb/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫一次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗体及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血清抗体滴度明显高于对照组,pCR3.1-C组的刺激指数明显高于pCR3.1-S注射组。结论 HBV S和C基因疫苗诱导较强的体液和细胞免疫应答强度;C基因尤以细胞免疫增高明显。