cDNA文库构建方法新进展

用核酸，抗体探针筛选ｃＤＮＡ文库是早期寻找基因的主要手段，也是目前克隆功能相关基因的ｃＤＮＡ的常用方法。本文在经典ｃＤＮＡ文库基础上发展而来的减数ｃＤＮＡ文库，标准化ｃＤＮＡ文库、染色体及其区域特异性ｃＤＮＡ文库构建方法的新进展作一综述。     

云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株cDNA文库构建和鉴定

目的 :构建云南个旧肺鳞癌YTMLC 90细胞株的cDNA文库。方法 :从培养的人肺鳞癌YTMLC 90细胞株中提取总RNA ,利用经修饰的oligo(dT)引物 (含SfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第1链。同时 ,根据真核生物mRNA 5′端帽子结构的特点 ,利用SMART核苷酸 (含SfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第 1链在mR NA 5′端延伸出去的模板。以此序列为引物 ,利用LD PCR(long distancePCR)合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经SfiⅠ酶切的载体λTripIE× 2 ,经体外包装即为cDNA文库。结果 :人肺癌细胞株YTMLC 90的cDNA文库中 ,含有 1.0 1× 10 9pfu/L个重组子 ,重组率为 93.2 %。将该文库扩增后 ,克隆数可达 5 .2 4× 10 12 pfu/L ,插入cDNA的长度为 75 0～ 30 0 0bp。结论 :所构建的cDNA文库具有较好的质量 ,为进一步筛选、克隆肺癌特异性表达基因奠定了基础。     

脉冲电磁场对破骨细胞和成骨细胞前体细胞作用的研究

目的 研究脉冲电磁场（PEMFs）对破骨细胞和成骨细胞前体细胞的作用。方法单独离体PEMFs作用：取8周龄雌性SD大鼠股骨骨髓细胞,根据PEMFs作用方式分为4个剂量组和对照组．分别进行成纤维细胞集落形成单位（CFU—F）和粒／巨噬细胞集落形成单位（CFU—GM）培养观察。活体结合离体PEMFs作用：取8周龄雌性SD大鼠随机分为3组：2—70组、OVX组和SHAM组,其中2．70组．OVX组进行双侧卵巢切除手术,SHAM组不切除卵巢。术后12周对2—70组大鼠进行PEMFs作用,OVX组和SHAM组不进行PEMFs作用。作用结束后,取大鼠股骨骨髓。根据体外培养过程中是否继续接受PEMFs作用,分为2—70PEMFs作用组／未作用组、OVXPEMFs作用组侏作用组、SHAMPEMFs作用组／未作用组,分别进行CFU．F和CFU．GM培养观察。结果单独离体PEMFs作用时,与对照组相比,4个剂量组的CFU-GM减少,CFU．F增加;活体结合离体PEMFs作用时,剂量组的CFU—F均增加,而CFU—GM各组间均无显著差异。结论单独离体PEMFs作用时,PEMFs对体外培养的破骨细胞前体细胞有抑制作用,对成骨细胞前体细胞增殖有促进作用;活体结合离体PEMFs作用时,PEMFs对成骨细胞前体细胞增殖有促进作用,但未见对破骨细胞前体细胞的抑制作用。     

PCR技术在cDNA文库构建中的应用

c DNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用。近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,c DNA文库的构建方法有了许多改进和提高。尤其是 PCR技术的发明和引进使从少量来源的组织和细胞中构建 c DNA文库成为可能。本文就 PCR技术在 c DNA文库构建中的应用方面的进展作一综述。     

骨质疏松症骨组织cDNA差减文库的构建

目的构建人抑制差减文库,为筛选骨质疏松骨相关基因奠定基础。方法分别从正常骨和骨质疏松症骨组织分离mRNA并反转录成cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接。经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA挑取克隆进行PCR扩增鉴定。结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含652、345个重组子;插入片段的平均大小为526bp。结论该差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明骨质疏松症的分子机制奠定了基础。     

高盐饮食通过激活破骨细胞促进小鼠骨质疏松发生

目的　明确高盐饮食对小鼠破骨细胞分化的影响及其促进骨质疏松的作用。 方法　获得C57小鼠骨髓单个核细胞,在体外定向诱导破骨分化体系中比较对照组（未加入氯化钠）、低剂量组（20 mmol/L氯化钠）及高剂量组（40 mmol/L氯化钠）破骨细胞生成数量;将24只C57小鼠随机平均分为正常组（普通饲料喂养）、卵巢切除组（切除卵巢,普通饲料喂养）、高盐饮食组（切除卵巢,8%高盐饲料+生理盐水喂养）,6周后分析3组左侧股骨破骨细胞生成数量并测定血清骨吸收及骨保护指标水平;选择右侧股骨进行显微CT扫描,比较3组骨组织形态计量学参数。 结果　体外高盐状态破骨细胞生成数量明显增加;体内高盐饮食组破骨细胞生成数量明显高于其它两组,I型胶原羧基端肽和核因子κ B受体活化因子配体不同程度增加,骨保护素水平显著降低,骨体积分数、骨皮质厚度、骨小梁数量和骨小梁厚度下降尤为明显,骨表面积/骨体积、骨小梁分离度和骨小梁模式因子不同程度增高。 结论　高盐饮食可通过激活小鼠破骨细胞分化及其功能活化增强骨吸收作用,进而诱导骨质疏松发生。     

建立小鼠成骨与破骨细胞相互作用的共育新体系

背景：众所周知,骨重建是骨组织中重要的生物学反应过程,其中成骨细胞与破骨细胞发挥了关键作用。但目前,关于骨重建中成骨与破骨细胞间信号传递的深层机制还不清楚。 目的：利用transwell技术,在体外建立一种成骨与破骨细胞的新型共育体系,为深入研究骨重建中成骨与破骨细胞的相互作用提供成熟的实验模型。 方法：采用MC3T3-E1成骨样细胞株与RAW264.7破骨前体细胞株,进行体外成骨与破骨细胞的诱导分化,并利用Transwell共培养板(0.4 µm聚酯膜)建立成骨与破骨细胞的共育体系。共培养6 d后,通过测定细胞活性和碱性磷酸酶(ALP)活力分析成骨细胞的增殖和分化活性,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝(TB)染色、TRAP活性测定及扫描电镜技术观察破骨细胞的分化及骨吸收功能。 结果与结论：共培养体系中成骨样细胞的无限增殖能力减弱,而分化活性明显增强,同时破骨前体细胞被诱导分化为成熟的破骨细胞,并具有一定的骨吸收功能。因此,该共培养体系可用于骨重建中成骨与破骨细胞间信号通路的深层研究。     

构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的:构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法:将不稳定型心绞痛病人(n=15)和稳定型心绞痛病人(n=15)的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交(SSH), 将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接, 采用1×TSS一步法转化大肠杆菌JM109, 获得消减cDNA文库, 采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果:各组cDNA文库各获得2000个阳性克隆, cDNA片段大部分分布于(200-600)bp之间。结论:本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库, 此cDNA文库有助于进一步筛选不稳定型心绞痛淋巴细胞中的差异表达基因。     

凋亡破骨细胞的拉伸应变

背景：力学应变在骨重建中起重要作用。然而,力学应变是否影响破骨细胞的凋亡仍不清楚。 目的：观察力学应变对体外培养破骨细胞凋亡的影响。 方法：对小鼠单核细胞RAW264.7采用巨噬细胞集落刺激因子和破骨细胞分化因子诱导,抗酒石酸酸性磷酸酶染色和骨吸收实验确定成功诱导出了破骨细胞。实验共分为3组,对诱导的破骨细胞分别施加0(对照组),2 500和5 000 με的基底拉伸应变3 d,1 h/次,1次/d。 结果与结论：与对照组相比,生理强度载荷2 500 με阻止了破骨细胞的凋亡和线粒体膜电位的下降。但是,病理强度载荷5 000 με对破骨细胞的凋亡和线粒体膜电位没有影响。     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

Construction and characterization of a vestibular-specific cDNA library using T7-based RNA amplification

 Using a very small amount of inner-ear tissue, we constructed a human vestibular cDNA library by means of T7-based amplification of RNA. This library should allow us to identify genes likely to be involved in auditory and vestibular functions. Here we first report the characterization of the human vestibular cDNA library. Among 506 cDNA clones randomly selected from the vestibular cDNA library, DNA sequences of 301 cDNA clones were identical to those of genes of known function. Twenty-two cDNA clones were considered to be novel because they did not match any cDNA sequences in the public database. The information in our study will provide a valuable resource for identifying several novel genes underlying deafness disorders and vestibular dysfunction. Received: November 25, 2002 / Accepted: December 3, 2002 Acknowledgments We thank all of the families whose participation made this project possible. We also thank Dr. Yasuhiro Inoue of Keio University School of Medicine for providing the surgical specimens. This work was supported in part by Research for the Future Program Grant #00L01402 from the Japan Society for the Promotion of Science. Correspondence to:Y. Nakamura     

Construction of a cDNA fragment library from SH-SY5Y cells using restriction display PCR

A complementary DNA (cDNA) fragment library from SH-SY5Y cells is constructed using a restriction display polymerase chain reaction (RD-PCR) technique. Messenger RNA (mRNA) is extracted from SH-SY5Y cells and single-strand cDNA synthesised using an anchored oligo primer (dT18). The second strand is produced by nick translation. The double strands are cleaved with the restriction enzyme Sau3AI and the fragments ligated with universal linker. The products are amplified with universal primers and selected primers, ligated into the pMDI8-T vector, and then sequenced. The library constructed contained 136 subgroups, each comprising seven to 12 cDNA fragments. RD-PCR proved a simple, effective way to construct a cDNA library, and this will contribute to the investigation of gene expression in the neuron in future microarray studies.     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

Cloning of B cell lymphoma-associated antigens using modified phage-displayed expression cDNA library and immunized patient sera

Active immunization of follicular lymphoma patients with idiotypic vaccines elicits antigen-specific antibody responses, T-cell responses, and antitumor effects. We hypothesized that these vaccinated patients could generate tumor-specific immune responses, not only against idiotype, but also against other tumor-associated antigens (TAA) by a mechanism of epitope spreading. To identify potential antigens, a phage surface expressed cDNA library derived from primary tumor cells was screened with sera from idiotype-vaccinated patients. Consistent with our hypothesis, we identified two immunogenic peptides (FL-aa-7 and 18), unrelated to idiotype, which were recognized by postvaccine sera but not by prevaccine or normal human sera. These peptide sequences derived from the 5'-untranslated regions of the human GTPase, IMAP family member 7 gene (FL-aa-7) and an alternative reading frame of U1-snRNP 70 (FL-aa-18), respectively, suggesting that epitope spreading had occurred.     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

Objective To construct and identify the cDNA library suitable for yeast expression of mouse macrophage by Gateway technique. Methods The mRNA extracted from mouse macrophage was purified. Moreover, cDNA were synthesized by biotin-conjugated Oligo (dT) primer. The double-strand cDNA was bound to attB Adapter and then purified by the cDNA size fractionation columns. BP recombination reaction between the attB- flanked cDNAs ( ＞500 bp) and attP- containing donor vector pDONRTM222 was performed, and the products were transformed into ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells to generate a Gateway entry cDNA library. Colonies were randomly selected from the plating assay plates. Plasmid DNA was isolated and the cDNA library qualified by plasmid digestion. A reading frame cassette to pGADT7 vector was ligated to construct a Gateway destination vector. The cDNA entry library was transformed into yeast expression library after LR recombination reaction with destination vector and the Gateway entry cDNA library. Results An entry cDNA library was constructed with a titer of (6.80±0.10)× 105 cfu/ml, total clones of 7.48×106 cfu, an average insertion size of about (2.20±0.20) kb and the percentage of recombinant clones was 100%. A yeast expression library was constructed with a titer of (3.24±0.10)× 106 cfu/ml, total clones of 3.89×107 cfu, a mean insertion size about (2.27±0.15) kb and the percentage of recombinant clones was 95.83% (23/24). Conclusion The entry cDNA library and the yeast expression cDNA library meet the requirements of standard library, thereby can be used in further study.     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定.方法 将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后,以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo(dT)为引物反转录后连接attB衔接子(attB Adapter),层析柱纯化,通过BP重组反应将500 bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONRTM222载体,电转化入ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells,构建Gateway入门cDNA文库,并完全随机挑取单菌落,提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小.构建Gateway目的 载体,通过LR重组反应将入门文库转入此目的 载体成为酵母表达文库,挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小.结果 经鉴定,入门文库平均滴度为(6.80±0.10)×105 cfu/ml,文库总容量为7.48×106 cfu,平均插入片段为(2.20±0.20)kb,重组率为100%.酵母表达文库平均滴度为(3.24±0.10)×106 cfu/ml,文库总容量为3.89×107 cfu,平均插入的片段为(2.27±0.15)kb,重组率为95.83%(23/24).结论 构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求,可用于进一步的研究.     

藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.