35例维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E7致癌基因突变分析

目的本研究旨在检测HPV16E7基因在新疆南部维吾尔妇女宫颈癌组织中的突变。方法从35份新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取组织DNA,作为模板,PCR扩增HPV16 E7全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV16E7基因的突变。结果PCR检测结果宫颈癌组织中HPV16E7阳性率为82.86%(29/35);27个E7分离片段的测序和序列分析表明,26个分离株E7基因与原型相同,1个分离株E7基因核苷酸发生2处突变,即647位(在HPV16基因组中的位置)的A→G,氨基酸由Asn变异为Ser;845位的T→C,氨基酸不变。结论新疆南部地区维吾尔妇女宫颈癌患者感染的HPV16中存在E7基因的变异株,该变异株可能是由人口流动传入。     

新疆哈萨克族食管癌组织中乳头瘤病毒16型E6E7基因的研究

为了解HPV16感染后E6E7基因变化在哈萨克族食管癌发病中的作用 ,以及HPV16E6E7基因与食管癌病理组织分级的关系 ,采用聚合酶链 (PCR)技术 ,检测 82例食管癌及癌旁正常食管粘膜组织中HPV 16E6E7基因差别。食管癌、癌旁正常粘膜组HPV16E6E7基因的检出率分别为 3 4. 15 % ( 14 /4 1)和 19. 5 1% ( 8/4 1) ,63 . 41% ( 2 6/4 1)和48. 78% ( 2 0 /4 1) ,差别均无显著性 (P >0 . 0 5 )。然而 ,在食管癌组织的高分化组、中低分化组中HPV16E6E7的检出率分别为 7. 69% ( 1/13 )和 46. 43 % ( 13 /2 8) ,3 8. 46% ( 5 /13 )和 75 % ( 2 1/2 8) ,差别均有统计学意义 (P <0 .0 5 )。提示HPV16E6E7基因与哈萨克族食管癌的发生及癌组织分级密切相关。     

HPV16 E6/E7基因及蛋白表达与宫颈癌的相关性研究

目的研究人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E6／E7基因及其蛋白表达在宫颈疾病及其癌变中的作用。方法运用PCR技术检测51例宫颈癌（癌症组）、20例富颈上皮瘤变（CIN）Ⅱ～Ⅲ级（CIN组）、20例宫颈炎（炎症组）患者病变组织中HPV16 E6／E7基因，并运用免疫组化SP法检测癌症组癌组织中HPV16E6、E7的表达情况。结果癌症组、CIN组、炎症组HPV16 E6检出率分别为5％、35％、45％．后两者明显高于前者（P〈0．05），HPV16 E7检出率分别为65％、75％、68．6％，P均〉0．05；癌症组45例HPV16 E6和42例E7蛋白阳性表达（88．2％、82．3％）。HPV16 E6蛋白表达与临床分期、肿瘤分化程度和淋巴结有无转移均无相关性（P〉0．05），HPV16 E7蛋白表达与临床分期和淋巴结有无转移相关（P〈0．05），与肿瘤分化程度无相关性（P〉0．05）。结论HPV16 E6／E7基因与宫颈疾病及其癌变的关系密切。     

人乳头瘤病毒16型早基因E6/E7编码区序列变异研究

目的获取人乳头瘤病毒16型早基因E6/E7的编码区序列并进行变异分析,为新型分子诊断方法的研发提供目标序列。方法通过导流杂交基因芯片技术获取人乳头瘤病毒16型感染宫颈脱落细胞。设计特异性引物,扩增人乳头瘤病毒16型早基因E6/E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析。结果通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞的分型检测,获得了人乳头瘤病毒16型感染阳性标本;选择其中3份阳性标本核酸为模板,通过特异性引物均成功扩增出大小介于750 bp和1 000 bp之间的目的序列;分别克隆到T载体上并测序,得到3条人乳头瘤病毒16型早表达基因E6/E7的编码区序列,克隆并测序后向GenBank核酸数据库提交获收录,登录号分别为EU869316、EU869317和EU869318;经BLAST分析,3条序列与GenBank序列PPH16（Accession：K02718）的E6/E7编码区序列一致性均为99%,且存在8种碱基置换,其中4种为同义突变,另4种则可引起所编码的相应氨基酸残基改变。结论本研究得到了与HPV高危型16型PPH16高度相似的E6/E7编码序列,为HPV致病机制和新型分子检测方法研究奠定了基础。     

局部细胞中HPVl6基因表达量及突变与其宫颈持续感染的关系

目的探讨宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒（HPV）16基因的表达量及突变与其宫颈持续感染的关系。方法选取96例HPVl6感染患者,其中33例宫颈脱落细胞HPVl6持续阳性（持续感染组）,63例6个月后复查转为阴性（非持续感染组）。采用半定量PCR技术检测两组（宫颈脱落细胞中）HPVl6E5、E6、E7及长控制区（LCR）基因表达量,基因测序法检测HPVl6E5、E6、E7及LCR基因突变。结果持续感染组HP~16E5、E6、E7、LCR基因表达量分别为0．20±0．02、0．30±0．02、0．19±0．01、0．53±0．02,非持续感染组分别为0．17±0．02、0．27±0．03、0．16±O．06、0．504-0．04,两组比较P均〉0．05。持续感染组与非持续感染组3978A→c（144L）位点突变例数分别为33、63例,4041A→G（165V）位点突变例数分别为33、63例,4076A—T（同义突变）位点突变例数分别为28、31例;两组4076A→T突变例数比较,P〈0．01。持续感染组与非持续感染组E6基因178T→G（D25E）位点突变例数分别为10、4例,两组比较,P〈0．05;持续感染组与非持续感染组E7基因647A→G（N29S）与846T→c（同义突变）联合突变例数分别为9、8例,两组比较,P〉0．05;持续感染组与非持续感染组7761c→T位点突变例数分别为33、63例,P〉0．05;7727A→c位点突变例数分别为14、4例,两组比较,P〈0．01。结论宫颈脱落细胞中HPVl6基因表达量与持续性感染无密切关系,HPVl6E5、E6、LCR基因突变与宫颈持续性感染有关,其中HPVl6E54076A→T（同义突变）、E6178T→G（D25E）与LCR7727A→c突变点可能是导致HPVl6持续感染的关键突变位点。     

人子宫颈癌组织PD-L1表达及其与HPV16E6/E7的相关性

目的探讨PD-L1在宫颈癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测40份宫颈癌组织(宫颈癌组)、25份宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ、Ⅲ级组织(CIN组)、8份正常宫颈组织(正常组)中程序性死亡配体1(PD-L1)、HPV16E6/E7(人乳头瘤病毒16型E6/E7)表达并分析二者的相关性。结果宫颈癌组、CIN组均有PD-L1、HPV16E6/E7表达,宫颈癌组表达明显高于CIN组(P<0.01);PD-L1与HPV16E6/E7表达呈正相关,r=0.531,P<0.01。正常组未见二者表达。结论 PD-L1在人子宫颈癌中发生、发展中起促进作用。     

人乳头状瘤病毒16型E6E7基因与MCA、TPA协同诱导细胞恶性转化的实验研究

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16型E6E7基因与化学致癌物MCA、TPA对Balb/c 3T3细胞恶性转化的协同作用。方法构建含HPV16 E6E7基因的重组质粒,用其转染Balb/c 3T3细胞。采用RT-PCR和Westernblot技术检测HPV16 E6E7基因和蛋白表达;应用细胞转化实验研究由MCA和TPA诱导的细胞恶性转化;并检验转化细胞在软琼脂上形成集落的能力及对SCID小鼠的致瘤能力。结果转染HPV16 E6E7基因的细胞比未转染细胞形成更多的转化灶,转化灶个数增加4～25倍,且实验时间明显缩短;其转化细胞在软琼脂上形成集落的能力及对SCID小鼠的致瘤能力更强。结论 HPV16 E6E7基因与MCA、TPA可协同诱导Balb/c 3T3细胞恶性转化。     

人乳头瘤病毒16型E7疫苗的研究进展

自从 1977年ZurHausen氏提出人乳头瘤病毒 (HuamnPapil lomavirus ,HPV)是妇女宫颈癌病因的假说以来 ,几十年来对HPV的基因及蛋白等结构和功能的研究表明 ,HPV16型是引发宫颈癌等多种肿瘤的主要病毒。它的致癌基因E6/E7在HPV16型致病过程中有重要的作用。针对于HPV16型E7的疫苗研究将有可能为病毒引起的肿瘤的预防和治疗带来新的途径。1　人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)与疾病的关系乳头瘤病毒的许多基本特征不同于空泡病毒 ,已经被分成一类独立的病毒[1] 。人乳头瘤病毒以人为单一宿主 ,常存在于人体各部 ,是嗜上皮性病毒。主要引起…     

新疆妇女宫颈脱落细胞HPV16E6基因的PCR及荧光定量PCR检测

目的:了解新疆妇女人乳头瘤病毒16型(13PV16)的感染状况。方法:用PCR及荧光定量PCR(FQ—PCR)方法检测妇科门诊普通患宫颈脱落细胞及分泌物中人乳头瘤病毒16型E6基因(HPV16E6),以普通门诊患宫颈脱落细胞及分泌物DNA作为样本,以人乳头瘤病毒(HPV16E6)作为扩增的靶基因,同时以人β—actin基因片段作为细胞内参照,借助于两对引物,两个特异的荧光探针,用荧光定量PCR(FQ—PCR)方法对这两个片段进行扩增,得到单位细胞HPV16E6的相对含量;同时进行定性PCR检测。结果:宫颈脱落细胞标本159例中,β—actin阳性154例;HPV16E6阳性共12例,阳性率为7．8％。PCR与FQ—PCR结果基本一致,但FQ—PCR更敏感。结论:建立的FQ—PCR检测宫颈脱落细胞内：HPV16E6基因的方法,能反映单位细胞内病毒的复制情况,可用于性传播感染(STI)及宫颈癌的筛查。     

植酸酮对宫颈癌细胞株中 HPV16／18 E6／E7 mRNA 及蛋白表达的影响

目的观察植酸酮对宫颈癌细胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响。方法体外培养Caski细胞株(含HPV16)与Hela细胞株(含HPV18),将所有细胞分成实验1、2、3、4组和对照组,每组均包含Caski细胞和Hela细胞。实验1、2、3、4组分别加入含58.6、117、586、5 860 mg/L植酸酮的培养液,对照组加入不含植酸酮的培养液。各组培养72 h后,采用real-time PCR法分别检测HPV16/18 E6/E7 mRNA,采用Western blotting法检测E6/E7蛋白。结果实验1、2、3、4组同一型别细胞中E6/E7 mRNA及蛋白相对表达量低于对照组,且实验1、2、3、4组E6/E7 mRNA及蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05)。各实验组内,Caski细胞中E6/E7 mRNA相对表达量低于Hela细胞(P均<0.05)。各实验组内同一型别细胞中,E6 mRNA相对表达量低于E7 mRNA(P均<0.05)。结论植酸酮可下调人宫颈癌细胞株中HPV16/18 E6/E7 mRNA及蛋白表达,且作用呈剂量依赖性;植酸酮对HPV16 E6/E7 mRNA的抑制作用强于HPV18 E6/E7 mRNA,并可能以抑制E6 mRNA表达为主导。     

宫颈细胞 HPV E6／E7 mRNA 检测在宫颈病变诊断中的价值

目的：评价高危型人乳头状瘤病毒（ HPV） E6/E7 mRNA检测对宫颈病变的诊断价值。方法520例患者采用b-DNA技术检测HPV E6/E7 mRNA,并用宫颈液基细胞学（ TCT）行宫颈细胞学检查,对其中任何一项阳性者做阴道镜下宫颈活组织检查,以组织病理为金标准,计算HPV E6/E7 mRNA阳性对高级别宫颈上皮内瘤样病变（ CIN）、宫颈浸润癌诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值,并与TCT检查进行比较。结果520例患者中HPV E6/E7 mRNA阳性158例, TCT异常222例。 TCT 异常者中HPV E6/E7 mRNA阳性率较TCT 正常者中HPV E6/E7 mRNA阳性率高（P＜0．05）。146例慢性宫颈炎、CINⅠ级患者与124例高级别CIN、宫颈浸润癌患者中HPV E6/E7 mRNA阳性率比较,P＜0．05。 HPV E6/E7 mRNA阳性对高级别CIN及宫颈浸润癌诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为74．19％、83．33％、58．23％、71．43％,TCT 检查分别为81．53％、69．44％、81．45％、92．28％,两者特异度及阳性预测值比较, P均＜0．05。结论在宫颈癌筛查中检测高危型HPV E6/E7 mRNA对预测高级别CIN,尤其对评估癌症风险有重要的临床价值。     

广州东部HPV基因型分布及其优势基因型E6／E7核酸序列分析

目的研究广州东部人乳头瘤病毒基因型分布特征,并获取优势基因型早基因E6／E7的核酸序列,进行变异分析,为本课题组下一步新型分子诊断方法的研发提供目标序列。方法通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的人乳头瘤病毒基因分型检测,分析本地区基因型分布特征,确定优势基因型;根据GenBank序列设计特异性引物,用于扩增优势基因型的早基因E6／E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析。结果通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的分型检测,检测了536份宫颈脱落细胞标本,HPV阳性占27.2％（146／536）,其中多基因型感染占29.5％（43／146）,高危型感染中52型为优势基因型,频数达23.3％（37／159）。HPV感染与52型HPV感染的年龄分布显示低年龄组（即A组,≤25岁）妇女最高。3份52型HPV感染阳性标本的核酸模板,通过特异性引物均成功扩增出大小接近750bp的目的序列;分别克隆到T载体上并测序,得到3条人乳头瘤病毒52型早表达基因E6／E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析;3条序列经BLAST分析,与GenBank数据库HPV52型序列（Accession：X74481）的E6／E7编码区序列一致性均为99％,三条序列（EU924143、EU924144、EU924145）存在6种碱基置换,其中2种可引起所编码的相应氨基酸残基改变。结论本研究可确认广州东部地区妇女宫颈感染HPV中A组（17-25岁）具有最高的感染率;宫颈感染HPV的优势基因型为52型;我们通过克隆策略得到了与HPV高危型52型X74481高度相似的E6／E7编码序列,为课题组后续进行的HPV致病机制和新型分子检测方法研究提供了重要基础。     

The state of the p53 and retinoblastoma genes in human cervical carcinoma cell lines.

Human cervical carcinoma cell lines that were either positive or negative for human papillomavirus (HPV) DNA sequences were analyzed for evidence of mutation of the p53 and retinoblastoma genes. Each of five HPV-positive cervical cancer cell lines expressed normal pRB and low levels of wild-type p53 proteins, which are presumed to be altered in function as a consequence of association with HPV E7 and E6 oncoproteins, respectively. In contrast, mutations were identified in the p53 and RB genes expressed in the C-33A and HT-3 cervical cancer cell lines, which lack HPV DNA sequences. Mutations in the p53 genes mapped to codon 273 and codon 245 in the C33-A and HT-3 cell lines, respectively, located in the highly conserved regions of p53, where mutations appear in a variety of human cancers. Mutations in RB occurred at splice junctions, resulting in in-frame deletions, affecting exons 13 and 20 in the HT-3 and C-33A cell lines, respectively. These mutations resulted in aberrant proteins that were not phosphorylated and were unable to complex with the adenovirus E1A oncoprotein. These results support the hypothesis that the inactivation of the normal functions of the tumor-suppressor proteins pRB and p53 are important steps in human cervical carcinogenesis, either by mutation or from complex formation with the HPV E6 and E7 oncoproteins.     

Human papillomavirus 16 E6 expression disrupts the p53-mediated cellular response to DNA damage.

Infection with certain types of human papillomaviruses (HPV) is highly associated with carcinomas of the human uterine cervix. However, HPV infection alone does not appear to be sufficient for the process of malignant transformation, suggesting the requirement of additional cellular events. After DNA damage, normal mammalian cells exhibit G1 cell-cycle arrest and inhibition of replicative DNA synthesis. This mechanism, which requires wild-type p53, presumably allows cells to undertake DNA repair and avoid the fixation of mutations. We directly tested whether the normal response of cervical epithelial cells to DNA damage may be undermined by interactions between the E6 protein expressed by oncogenic HPV types and wild-type p53. We treated primary keratinocytes with the DNA-damaging agent actinomycin D and demonstrated inhibition of replicative DNA synthesis and a significant increase in p53 protein levels. In contrast, inhibition of DNA synthesis and increases in p53 protein did not occur after actinomycin D treatment of keratinocytes immortalized with HPV16 E6/E7 or in cervical carcinoma cell lines containing HPV16, HPV18, or mutant p53 alone. To test the effects of E6 alone on the cellular response to DNA damage, HPV16 E6 was expressed in the carcinoma cell line RKO, resulting in undetectable baseline levels of p53 protein and loss of the G1 arrest that normally occurs in these cells after DNA damage. These findings demonstrate that oncogenic E6 can disrupt an important cellular response to DNA damage mediated by p53 and may contribute to the subsequent accumulation of genetic changes associated with cervical tumorigenesis.