重庆三峡库区2012年乙脑病毒分离株基因序列分析

目的 通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列,揭示毒株的遗传特性。方法 对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增,将扩增产物测序。用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果 新分离的8株乙脑病毒株均为基因I型,与我国其他省市的既往分离株进化关系较近;分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比较,PrM区核苷酸同源性在85.1%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～96.3%之间;E基因区核苷酸同源性在87.6%～87.8%之间,氨基酸同源性在96.9%～97.1%之间。所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点。结论 2012年8株重庆乙脑分离株为基因I型,在E基因区域与疫苗株相比有部分差异。     

福建省2005-2008年临床乙脑病毒分离株的序列分析

目的分析2005-2008年福建乙脑病毒毒株的部分基因组序列,探索乙脑病毒临床分离株的变异和进化。方法临床标本(血清或脑脊液)接种BHK-21细胞,分离乙脑病毒,从培养液上清提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒基因组片段,并进行克隆、测序以及序列分析。结果共分离到5株乙脑病毒。对病毒C/prM区240bp和全长E基因的序列分析表明,近几年的这些临床分离株基因型仍然全部属于G3型。种系发生分析结果显示,新分离株与2002、2003年分离株存在较大同源性。虽然病毒E基因存在少量氨基酸改变,但总体上这些变异不足以影响病毒的致病性。结论近几年福建省的临床乙脑病毒分离株为G3型,新分离株亲缘关系比较接近2002、2003年毒株。     

广西新分离流行性乙型脑炎病毒GP0722株全基因组分子特性研究

目的 对广西新分离乙脑病毒GP0722株进行全基因序列测定和分析,了解其基因组结构及毒力特征。方法 应用乙脑病毒全基因组扩增引物进行RT-PCR扩增,PCR产物直接测序,拼接后得到全基因序列。应用Clustal X(1.8)、DNASTAR、Mega 4. 1等生物软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果 广西新分离乙脑病毒GP0722全基因长10 965个核苷酸,从97到10 395位编码一个开放阅读框,编码3 432个氨基酸,与目前使用的减毒活疫苗株SA-14-14-2株比较,只有88.9%的核苷酸同源性,97.6%的氨基酸同源性,全基因组共存在1 222个核苷酸差异,83个氨基酸差异。与GenBank中选择的21株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸总体差异率为0.9%~18.8%,氨基酸总体差异率为0.1%~5.2%。通过PrM/C区段、E区段、3′NTR区段和全基因序列进行系统进化分析显示该毒株属于基因1型乙脑病毒。结论 新分离的乙脑病毒GP0722株属于基因1型,与JEV/sw/Mie/40/2004进化关系最近,与疫苗株SA-14-14-2相比关键位点氨基酸未见变异,现行使用的疫苗仍能保护GP0722引起的感染。     

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定

目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM-E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14 14 2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。     

流行性乙型脑炎80例临床分析

流行性乙型脑炎是一种急性中枢神经系统传染病。临床以高热、惊厥、呼吸衰竭为主要表现，重症患者病死率高或遗留后遗症。现将泸州医学院附属医院2006—07／08收治的80例流行性乙型脑炎病例分析如下。     

3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒全基因序列测定和分析

目的对3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒进行全基因测序,并与疫苗原始种子序列进行比较。方法随机选取某厂家生产的3批乙脑减毒活疫苗,提取病毒全基因组RNA,逆转录为cDNA后分段PCR扩增并测序。序列拼接后利用MegAlign软件与GenBank中乙脑减毒活疫苗原始种子全基因序列进行同源性比较。结果 3批乙型脑炎减毒活疫苗病毒基因组全长10 977个核苷酸,与乙脑减毒活疫苗原始种子序列同源性为100%。结论三批次乙型脑炎减毒活疫苗遗传特性高度稳定。     

猪嵴病毒福建株全基因克隆及序列分析

目的为研究猪嵴病毒（porcinekobuvirus,PKV）福建株的基因组结构特征。材料与方法根据猪嵴病毒基因组特征设计特异性朝物,运用RT—PCR方法,对猪嵴病毒福建株进行全基因克隆,并运用RACE方法对猪嵴病毒福建株的5,和3’末端进行扩增。结果与结论所获得的猪嵴病毒福建株基因组全长为8210bp,其5’末端长度为576bp·3’末端长度为167bp,编码一个大的多聚蛋白,长度为7467bp,编码2488个氨基酸。其多聚蛋白核苷酸同源性和我国猪嵴病毒分离株cH／HNxx-4／2012（GenBank登录号JX401523）同源性最高,均为89．2％,和匈牙利猪嵴病毒分离株swine／S—1-HUN／2007／Hungary（GenBank登录号（GenBank登录号EU787450）同源性最低,达87．6％。     

浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及细胞分离鉴定北大核心CSCD

目的了解浙江地区狂犬病分子流行病学现状,为浙江地区狂犬病防控提供相关数据。方法使用RT-PCR扩增浙江狂犬病病毒街毒株核苷酸并进行全基因组序列测定,与32株中国狂犬病病毒街毒株基因序列进行比对分析;使用Neuro-2a细胞进行病毒分离,测定不同代次全基因组序列并比较核苷酸突变情况。结果获得了全长为11782 bp的全基因组序列,经过比对分析后发现该毒株属于ChinaⅠ型,与全部参考基因Ⅰ型病毒核苷酸序列一致性为97.10%~99.31%;通过Neuro-2a细胞成功分离到狂犬病病毒,连续三代培养后病毒滴度最终达到5.71×10^(7)FFU/mL,子代之间序列一致性在99.9%以上,其中F3代较F1代核苷酸序列发生了7个位点突变,氨基酸未发生改变。结论新狂犬病病毒分离毒株(ZJSX-2021)属于ChinaⅠ型,与以往分离毒株属同一基因型,表明狂犬病病毒近年在浙江地区仍持续传播。细胞分离后病毒序列并无明显变化。     

两株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与分析

目的对2株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组测序,了解国内狂犬病病毒的流行和变异情况。方法采用乳鼠脑内接种方法分离2株天津地区狂犬病病毒街毒株,RT-PCR扩增病毒DNA覆盖全基因组12个相互重叠的基因片段,PCR产物平端克隆后进行全基因组核苷酸序列测定,然后对其分子变异和进化特点进行分析。进行两分离株的序列相似性、氨基酸同源性、主要功能位点的变异比较和种系发生分析。结果 TJD04和TJD05两株狂犬病病毒全基因组长均为11 924 nts,全基因组序列的组成和结构均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征。病毒基因组由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,氨基酸编码长度未发生变异,5个编码蛋白序列较少发生变化,仅有个别主要功能位点发生变异,且大部分变异均属于无意义沉默突变。多序列相似性比较和种系发生分析显示,两株病毒均属于基因1型,N基因与全基因进化树保持一致,与中国犬源狂犬病病毒BD06同源性最高(99.6%),进化关系近,并具有较为独特的中国地域特点。结论两天津株狂犬病毒可能是自然界中固有的狂犬病病毒街毒株。     

一株神经外低毒力乙型脑炎病毒株的全基因序列分析

目的探究1株新分离的基因Ⅰ型乙脑病毒株的分子生物学特征及其低毒力的分子基础。方法对病毒株扩增,提取其RNA,逆转录PCR后测序,序列与来自世界不同地区不同基因型的野毒株进行同源性比较,并与强毒P3株进行氨基酸位点比对。结果SC04-17在核苷酸和氨基酸序列上,存在与其他基因型毒株不同的特点,与世界各地毒株核苷酸差异率为1.8%～16.5%,氨基酸差异率为0.8%～5.0%;与减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸、氨基酸同源性分别为88.5%和97.6%,与灭活疫苗株P3核苷酸、氨基酸同源性分别为88.8%和97.9%;与P3强毒株比对,发现72个氨基酸位点差异,分布在全基因的各个区域（E、NS5、NS1和NS3区）。结论SC04-17株的基因序列存在一些独特位点,这些位点的氨基酸变化可能与其低毒力特征有关。     

日本脑炎病毒DNA疫苗和基因工程亚单位颗粒疫苗的动物保护实验研究

目的　评价 3种日本脑炎病毒 (JEV)新型疫苗 ,即E蛋白病毒样颗粒 (VLPs)、DNA疫苗 (pV/JE)以及E蛋白颗粒 (Eps)的动物免疫效果。方法　BALB/c小鼠经 2次接种疫苗后 ,测定其病毒特异性的CTL活性、结合抗体、中和抗体 ,并以10LD5 0JEV攻击免疫小鼠 ,观察其保护效果。结果　各新型疫苗组的CTL活性为 33%～ 5 6 % ,灭活疫苗组为 2 2 % ,而载体和PBS对照组的CTL活性分别为 17%和 18%。一次免疫后 ,实验组小鼠血清结合抗体阳转率为 90 %。除DNA疫苗组外 ,各组小鼠的二次免疫血清抗体效价高于一次免疫的抗体效价 (P <0 0 5 ) ,且以VLPs加佐剂组小鼠血清抗体效价最高 ,Eps加佐剂组次之 ,均高于 pV/JE组和灭活疫苗组 (P <0 0 5 )。三种疫苗可诱发小鼠产生中和抗体。各实验组小鼠能够抵抗JEV的攻击 ,而对照组小鼠的死亡率为 37 5 %。结论　三种新型疫苗可以正确表达JEV的E蛋白表位 ,可诱发免疫小鼠产生抗JEV的中和抗体并有保护性作用 ,免疫效果优于灭活疫苗 ,有可能成为候选的JEV新型疫苗。     

实时荧光RT-PCR检测凝血块中乙脑病毒RNA

目的探索建立灵敏便捷的乙脑病毒核酸检测方法,为临床疑似乙脑病例提供可靠辅助诊断依据。方法采用基于SYBR Green I染料的实时荧光RT-PCR方法,对一系列乙脑病毒检测引物进行综合评价,并应用于部分临床确诊或疑似乙脑病例血清和凝血块中病毒核酸检测。结果根据9对引物检测连续稀释病毒RNA的扩增曲线和融解曲线,筛选出1对灵敏度和特异性较好的引物。该体系分别检测15份乙脑病毒IgM阳性和15份IgM阴性患者的血清和凝血块中提取的核酸,血清样品全部为阴性,而凝血块样品发现7份核酸阳性。结论从患者凝血块中提取核酸样品,可以用于JEV感染的实验室诊断。在我们建立的乙脑病毒核酸实时荧光PCR检测体系中,首次发现凝血块样品比血清样品灵敏度更高,说明凝血块用于病毒性脑炎实验室诊断具有重要价值。     

一株特殊抗原性乙脑毒株的分子生物学特征研究

目的对一株抗原性特殊的乙脑毒株进行生物学和分子生物学特征研究,以找出特殊抗原性的分子生物学基础。方法通过空斑减少交叉中和试验对乙脑病毒KT株的抗原性进行比较。提取KT株RNA,逆转录后扩增其E基因片段并测序,通过Blast与GenBank中所有乙脑病毒基因进行核苷酸和氨基酸序列比对,利用PdbViewer对KT株关键位点突变后的空间构象进行预测比对。结果交叉中和试验显示,KT株免疫血清对其他株乙脑病毒的中和作用较低,而其他乙脑病毒免疫血清对KT株的中和作用也较低。对E基因序列进行比对,KT株属于基因Ⅲ型,氨基酸序列上只在E62位存在一个独特的位点突变:组氨酸(H)→精氨酸(R)。空间构象显示,该位点位于结构域Ⅰ与结构域Ⅱ的连接交界处,当发生由组氨酸(H)到精氨酸(R)突变时,其与周围氨基酸形成的氢键数量和长度发生改变,空间构象也随之发生改变。结论乙脑病毒KT株的抗原性与其他乙脑病毒株存在较大差异,E62位组氨酸(H)→精氨酸(R)的突变是导致其抗原性差异的主要原因。     

乙型脑炎病毒分型基因芯片的制备

目的制备乙型脑炎病毒分型基因芯片。方法根据乙型脑炎病毒的基因组学序列,应用生物学软件设计乙型脑炎病毒分型引物及探针,制备JEV分型基因芯片。PCR扩增荧光标记的片段与固定于玻片上的探针杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。通过特异性、灵敏性、重复性试验验证,建立分型基因芯片检测方法。结果杂交显示,设计的6条探针中有3条特异地与相应的标记样品杂交并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号,其中1号探针能特异性检出乙型脑炎病毒,4、5号探针可对JEV-Ⅰ和JEV-Ⅲ型进行分型。制备的基因芯片具有可靠的重复性。结论建立的基因芯片具有高特异性、灵敏性及良好的重复性,可以快速、准确、高通量地对乙型脑炎病毒进行分型检测。     

三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较

目的 比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法 选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果 中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian,Lvshiyuan和Tianchen阳性检出率分别为50.0%(45/90), 47.8%(43/90)和 38.9%(35/90)。灵敏度最高的是Keqian,为90.32%,但其特异度只有71.19%;Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%;Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别仅为41.94%和16.95%。与中和试验比较,Tianchen试剂盒的κ系数最高为0.63,其次是Keqian为0.57,Lvshiyuan仅为0.04。显示3种试剂盒具稳定性。结论 目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大,与中和试验相比存在较高的假阴性,质量有待提高。     

固定床生物反应器生产高滴度乙型脑炎病毒的研究

目的 研究用固定床生物反应器生产乙型脑炎病毒的工艺。方法 在生物反应器中培养Vero细胞,接种并培养乙型脑炎病毒。结果 用工作体积3．5L的生物反应器生产出病毒滴度〉8．01gLD50／ml的乙型脑炎病毒80L。结论 用固定床生物反应器可以生产出高滴度的乙型脑炎病毒,为进一步生产高质量的乙型脑炎疫苗打下良好基础。